[发明专利]一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用。本发明的制备方法包括一步化学法与多种酶催化法有序进行的步骤：提取胞外多糖K5CPS，将其化学法N‑脱乙酰化/N‑硫酸化修饰后，再经肝素酶Ⅲ在缓冲溶液中部分解聚；所得到的低分子量产物依次进行酶法C‑5差向异构化/2‑O‑硫酸化修饰、6‑O‑硫酸化修饰、3‑O‑硫酸化修饰，得到具有抗FXa和FIIa活性的产物。本发明提供了制备具有肝素典型结构特征和显著抗凝活性的低分子量产物的新方法，该方法的原料非动物来源、质量可控、污染风险低，采用的反应条件温和、高效，所得产物易分离，能够实现结构均一性好、抗凝活性强的非动物源低分子量肝素的规模化制备。

技术领域

本发明涉及一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的、结构不均一的糖胺聚糖，是由葡萄糖胺(GlcN)与艾杜糖醛酸(IdoA)或葡萄糖醛酸(GlcA)以1,4-糖苷键连接而成的一种天然抗凝物质，其重均分子量在5000Da～25000Da之间。肝素作为抗凝药物应用于临床已经超过80年，至今发挥着无可替代的重要作用。

目前商品化肝素主要包括普通肝素、低分子量肝素，其中普通肝素又称未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)，主要从猪小肠黏膜、牛肺等动物脏器中提取得到；UFH经物理、化学或酶法部分解聚可得到重均分子量小于8000Da的产物即低分子量肝素(low-molecular-weight heparin,LMWH)。英国药典规定：LMWH的重均分子量一般不得大于8000Da，且其中重均分子量小于8000Da的物质至少应超过60％。LMWH具有体内半衰期长、生物利用度高，副作用小及使用安全等优点，近年逐渐替代UFH成为首选临床抗凝药物。但应用最广泛的化学法解聚反应条件剧烈，极易使肝素分子中的某些功能基团(如硫酸基团)丢失或被破坏，从而可能造成LMWH抗凝活性下降。

动物脏器来源的UFH及LMWH具有原料来源丰富、价格相对低廉、生产工艺成熟等优点。但是，此类结构复杂的动物源肝素质量控制难度大且存在被污染的可能，临床应用中存在较大的安全隐患，如疯牛病、非洲猪瘟的出现使人们对使用动物来源的肝素产生了担忧，特别是自2007年以来发生的多次肝素污染事件更加剧了人们对动物源肝素的恐惧。考虑到肝素在临床应用中的重要价值，寻求新的非动物源肝素受到广泛关注。其中，化学法合成发展迅速并成功实现了结构确定的、特异性抑制Xa活性的磺达肝素(fondaparinux)的上市，但因其合成步数多，总产率低(通常小于0.3％)，导致成本极高，在市场上几无竞争力。近期Jian Liu的团队(Science,2011，334(6055):498–501)通过模拟肝素的体内生物合成途径，发展了一种全新的化学酶法合成策略，以大约10步即可得到具有特异抗Xa活性的肝素寡糖，但面临制备规模小、成本偏高等挑战。

大肠杆菌K5(E.coli K5)等微生物能产生一种特殊的胞外多糖(K5CPS)，是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和α-D-N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)二糖重复单元[-GlcA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n组成的糖胺聚糖，被认为是未经修饰、重均分子量不同的肝素前体多糖。故而以K5CPS为原料被认为有望制备得到非动物来源的肝素及衍生物(中国现代应用药学，2019，36：114-119)。

国内外学者曾尝试以胞外多糖K5CPS为原料，采用多种策略进行修饰以制备具有抗凝活性的衍生物。研究证实，单纯的化学修饰方法反应条件剧烈、选择性差，且无法使糖链的GlcA残基转变为肝素所必需的2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)。相比之下，酶法修饰是较为可行的策略，例如Robert J.Linhardt课题组(Carbohydr Polym，2015，122:399-407)采用化学酶法修饰K5CPS，得到了抗Xa与抗IIa活性相当的衍生物，但该方法效率低、工艺稳定性差，难以真正实现规模化制备，而且所得产物的精细结构、重均分子量与肝素差别较大。迄今为止，以K5CPS为原料尚无法实现具有肝素/低分子量肝素的典型结构、抗凝活性强的非动物源产物的高效制备。

发明内容