[发明专利]一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法

权利要求书

1.一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从组织中筛选可溶性环氧化物水解酶的特异性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；以特异性多肽为标准品，利用质谱同位素内标定量法，通过液质联用的方法进行检测，以标准品的浓度为横坐标，定量子离子峰面积与同位素内标峰面积的比值作为纵坐标，建立标准曲线；

（2）通过液质联用的方法测定样品中特异性多肽的浓度，再转换计算得到样品中可溶性环氧化物水解酶的浓度；

其中，液质联用的具体色谱条件如下：

（1）液相色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18，4.6×100 mm，1.8 μm；保护柱：Agilent ZORAX SB-C18，2.1×12.5 mm，5 μm；流动相：A：B= 0.1% v/v甲酸水溶液：乙腈，梯度洗脱；柱温：40 ℃；

（2）质谱条件

采用AB公司API 4000 MS/MS质谱仪进行化合物检测，采用ESI离子源、正离子MRM模式检测，离子源参数如下：CAD：12；CUR：20；GS1：40；GS2：60；IS：5500；TEM：500；EP：10；CXP：9；

。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织为大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、胃、肌肉、脂肪、卵巢、睾丸、胎盘和血管中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，特异性多肽的筛选方法为向0.4 g组织中加入1 mL水匀浆后，于9000 g 4℃离心20min，取上清，即S9样品；测定S9样品的蛋白浓度；对S9样品进行酶法消化；对消化后的S9样品进行液质联用检测，筛选，即得特异性多肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酶法消化为向160 μg S9样品中加入10 μL 250 mM 的二硫苏糖醇水溶液和40 μL 100 mM的碳酸氢铵缓冲液，95℃灭活10min，然后加入20 μL 500 mM的1H-吲哚-3-羧酸（吲哚乙酸）水溶液，避光孵育30 min后，加入甲醇500 μL和去离子水400 μL，然后16000 g 4℃离心5 min，移去上层液体后加入60 μL碳酸氢铵缓冲液和20 μL浓度为160 μg·mL^-1胰蛋白酶碳酸氢铵水溶液于37℃消化16 h后，加入20 μL内标工作液和10 μL稀释液，于12000 g 4℃离心10 min，取上清液，即为消化后的S9样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的内标工作液为SEQ ID NO.1所示的特异性多肽的同位素多肽，其浓度为200 ng·mL^-1。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的内标工作液的制备方法包括如下步骤：

（i）用稀释液将4 μL 2.5 mg·mL^-1的内标多肽储备液稀释至1 mL，得到10 μg·mL^-1的内标稀释液；

（ii）用稀释液将20μL 10μg·mL^-1的内标稀释液稀释至1 mL，即得200 ng·mL^-1的内标工作液。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，测定S9样品的蛋白浓度的方法为BCA法。