[发明专利]一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法

说明书

本发明公开了一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法，其包括如下步骤：(1)从组织中筛选可溶性环氧化物水解酶的特异性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；以特异性多肽为标准品，利用质谱同位素内标定量法，通过液质联用的方法进行检测，以标准品的浓度为横坐标，定量子离子峰面积与同位素内标峰面积的比值作为纵坐标，建立标准曲线；(2)通过液质联用的方法测定样品中特异性多肽的浓度，再转换计算得到样品中可溶性环氧化物水解酶的浓度。本发明从具有代表性且性质稳定的特征肽段中选择酶解较稳定且酶解效率高的肽段作为定量肽段，具有准确、精密和灵敏等优点，可以有效地对大鼠组织中sEH进行准确的定量分析。

技术领域

本发明属于蛋白质绝对定量的方法，具体涉及一种液质联用(LC-MS/MS)检测可溶性环氧化物水解酶(sEH)的方法。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH)是一类普遍存在于哺乳动物、昆虫、植物、微生物生物体内的酶，能立体选择性地将水分子加到环氧化物上生成相应的1,2-二醇。可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)是环氧化物水解酶家族中的一员，是1973年由Gill等人在研究类似昆虫保幼激素萜类环氧化物的代谢时发现，因它主要位于细胞的可溶性成分如细胞质和过氧化物酶体中而命名。在哺乳动物系统中的sEH具有α/β水解酶折叠结构，能水解反式取代的环氧化物及一系列由脂肪酸转化而成的脂肪族环氧化物。这些环氧化物是体内重要的信号分子，能调节一系列生理机能，例如血管张力、炎症反应、血管生成和疼痛等。

花生四烯酸的CYP450表氧化酶代谢产物环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)是sEH的底物，具有抗炎、扩血管、降低血压、神经保护等作用，EETs经sEH代谢后生成活性较低的二羟基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs)。近年来，大量研究表明，抑制sEH的活性或者下调sEH表达的动物在炎症、糖尿病、心血管疾病、神经保护等各方面都表现出了优势，提示sEH在心肌肥厚、糖尿病、高血压、肾病、帕金森、抑郁症等疾病中都发挥了重要作用，是这些疾病潜在的治疗靶点。sEH已成为现阶段的研究热点。

目前，测定组织中sEH蛋白表达的方法主要有免疫组化和Western blotting法。但是，这两种方法都属于依赖于特异性的抗体的半定量方法，专属性较差，也不易于大批量样品的测定。随着质谱技术在蛋白质组学中的应用，使得LC-MS/MS绝对定量某个蛋白质成为可能。本方法测定的特异性多肽为大鼠sEH酶特有，专属性强。此外，质谱的高通量特性，较传统的Western blotting法大大缩短了分析时间，提高了工作效率。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种液质联用检测可溶性环氧化物水解酶的方法，从Uniprot数据库中获得可溶性环氧化物水解酶的氨基酸序列，将可溶性环氧化物水解酶用Skyline软件模拟酶解过程，得到一系列肽段。取0.4g大鼠组织，加入1mL水匀浆后，于9000g 4℃离心20min，取上清，得S9；测定S9样品的蛋白浓度；对S9样品进行酶法消化；对消化后的S9样品进行LC-MS/MS检测，筛选得到相响应好的特异性多肽为DFLLGAFQMK。制备这种特异性多肽的高纯度标准品和同位素内标，以特异性多肽的定量子离子峰面积与同位素内标峰面积的比值作为纵坐标绘制标准曲线，计算得到样品中这种酶的浓度。

具体的，其包括如下步骤：

(1)从组织中筛选可溶性环氧化物水解酶的特异性多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；以特异性多肽为标准品，利用质谱同位素内标定量法，通过液质联用的方法进行检测，以标准品的浓度为横坐标，定量子离子峰面积与同位素内标峰面积的比值作为纵坐标，建立标准曲线；