[发明专利]纳米级人工抗原呈递细胞αCD3-Origami aAPC及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞αCD3‑Origami aAPC及其制备方法，将M13mp18单链噬菌体DNA、组成核酸框架结构单链DNA、生物素修饰的单链DNA混合，通过梯度PCR仪进行95～25℃的梯度降温，得到生物素化的核酸框架结构；随后依次加入链霉亲和素和生物素化的抗‑CD3蛋白，室温震荡反应后，得到所述基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞(αCD3‑Origami aAPC)。本发明制备方法简单，合成步骤少，耗时短。本发明所述αCD3‑Origami aAPC用于T细胞激活，材料生物相容性好，实现T细胞快速、有效的增殖，具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种免疫制剂及其制备方法，特别是涉及一种可促进T细胞活化和增殖的基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞(αCD3-OrigamiaAPC)及其制备方法和应用。

背景技术

过继性免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。这种方法的关键是产生大量的功能性T细胞，以改善患者的免疫反应。因此，开发体外T细胞活化和增殖的培养平台尤为重要。在体内，T细胞活化是通过T细胞受体(TCR)识别抗原呈递细胞(APCs)表面同源多肽组织相容性复合物(pMHC)启动的。这种相互作用触发复杂的细胞内信号网络，最终导致细胞因子的产生(如IL-2)，细胞增殖，分化成不同的亚群。利用自体APCs作为T细胞体外刺激平台，由于合适的细胞数量和均一性差异较大，在实际应用中难以实现。

人工抗原呈递细胞(aAPC)已经成为一种比天然更容易生产、更经济可行的系统，大量基于细胞和非细胞的系统经过设计被用于APC的替代物。CD3(TCR复合物的信号转导组分)和CD28的激动抗体通常作为T细胞活化和增殖系统的天然配体的模拟物。其中抗CD3单克隆抗体(aCD3 mAbs)可以触发多克隆T细胞高效稳定的活化。

核酸纳米技术是一种自上而下的分子自组装模式，核酸被用作构建结构的材料单元，基于核酸分子的物理和化学性质自发地形成稳定的结构，遵循碱基互补配对原则，通过合理的设计碱基链实现纳米级复杂的精密控制，并可进一步实现蛋白分子的精确排布，能排布的对象多且可实现的分辨率高。

虽然许多关于人工APC系统的研究都集中在诱导或扩增特定T细胞表型所需要的分子信号类型上，但很少有人关注实现表面配体密度的精确控制。TCR配体的密度和数量对T细胞的总体信号强度有很大的影响。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于解决了人工抗原呈递细胞配体密度难以精准控制的问题，实现了配体分子在核酸框架结构上数目及相对位置的精准控制；选用生物相容性好的核酸框架结构作为原料，制备得到的基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞(αCD3-Origami aAPC)具有良好的生物相容性，有效快速地促进T细胞的活化和增殖。

本发明提出的制备可促进T细胞活化和增殖的基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞(αCD3-Origami aAPC)的方法，其反应机理如图1所示：

以长的M13mp18单链噬菌体DNA为支架，短的单链DNA作为“订书钉链”，根据核酸框架结构的可寻址性，通过合理设计，选择一定个数及位置(即单链DNA在整个核酸框架结构中的位置)的短的单链DNA做生物素化修饰，经过PCR退火处理后，形成有一定个数及位置的生物素化的核酸框架结构，所述核酸框架上修饰的生物素的个数由选取的短链DNA数目决定，所述核酸框架上修饰的生物素的位置与核酸框架结构设计图位置相对应。

通过链霉亲和素-生物素系统，即将链霉亲和素结合至修饰有生物素化DNA的位置，再以链霉亲和素为媒介将生物素化的抗-CD3蛋白定点结合到核酸框架结构上，即定点结合到设计所选取的生物素化DNA位置，最终形成基于核酸框架结构的纳米级人工抗原呈递细胞(αCD3-Origami aAPC)。