[发明专利]一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法

权利要求书

1.一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，配制TAP液体培养基、TAP固体培养基、含巴龙霉素的TAP固体培养基，备用；

步骤2，将莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000 Lx光强下连续光照并通气培养，经过转接与继续培养、处理后，即可进行转化；

步骤3，采用电击法向衣藻细胞中插入筛选基因片段aphVIII，造成随机位点突变，涂布于含巴龙霉素的TAP固体培养基平板，经过7-10天光周期培养，得到突变体文库单克隆藻；

步骤4，挑取直径异常的单克隆藻落转移至TAP固体培养基平板，进行培养；

步骤5，挑取步骤4培养的藻24孔板进行培养后，再利用酶标仪OD₄₃₄检测24 h与48 h两个时间点的藻液吸光值，计算吸光值比值，记为复制比，以未进行突变的野生型的复制比为标准，筛选获得在同样的时间段内复制比明显低于或高于野生型的，即得到目标周期调控缺陷突变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TAP液体培养基的组成为：25 mL/L 的TAP盐溶液、0.375 mL/L的磷酸盐溶液、1 mL/L 的Hutner微量元素溶液、1 mL/L的乙酸、2.42 g/L 的Tris；

其中：TAP盐溶液的组成为：NH₄Cl 15 g/L、MgSO₄•7H₂O 4 g/L、CaCl₂•2H₂O 2 g/L；磷酸盐溶液的组成为：K₂HPO₄ 288 g/L、KH₂PO₄ 144 g/L；Hutner微量元素溶液的组成为：EDTA二钠盐 50 g/L、 ZnSO₄•7H₂O 22 g/L、H₃BO₃ 11.4 g/L、MnCl₂•4H₂O 5.06 g/L、CoCl•6H₂O1.61 g/L、CuSO₄•5H₂O 1.57 g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄•4H₂O 1.1 g/L、FeSO₄•7H₂O 4.99 g/L，用KOH或者HCl 调节pH至7.0；

所述TAP固体培养基是向TAP液体培养基中加入15 g/L 琼脂粉后灭菌倒平板制成；

所述含巴龙霉素的TAP固体培养基是向TAP液体培养基中加入15 g/L 琼脂粉后灭菌，冷却至55°C后添加终浓度为10 μg/mL巴龙霉素倒平板制成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：电击法是使用电击仪 BTX ECM830，设置参数为500 V、4 ms、6波段，间隔时长100 ms，进行电击。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选基因片段aphVIII是从大小为6.6Kb 的pJMG-aphVIII质粒中，经过内切酶 EcoRI 酶切，回收获得的大小为2.2Kb 的抗巴龙霉素片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中具体是将野生型莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000 Lx光强下连续光照并通气培养3-4天，转接过程是使得藻液初始浓度为1×10⁶ 个/mL，在上述条件下吹气培养20 h，终浓度达5×10⁶个/mL进行转化。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中培养是在22.5-23.5℃，按白天14h、夜晚10 h的光周期，8000 Lx光强下倒置培养7-10天。