[发明专利]一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法

说明书

本发明公开了一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法。具体是在莱茵衣藻突变体文库建立后直接进行细胞周期调控缺陷突变体，初筛根据单克隆直径大小，复筛再利用酶标仪OD₄₃₄检测细胞浓度，从而计算24 h与48 h的吸光值比值，从而参照野生型复制比筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷的突变体。本发明利用酶标仪来检测莱茵衣藻细胞数量的变化，以此来筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷的突变体。该方法操作简便，效率较高，能够快速且稳定的获得细胞周期调控缺陷的突变体，为后续的实验打下了基础。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法。

背景技术

莱茵衣藻是一种单细胞真核藻类，特点在于生长迅速，世代周期短，细胞周期调控方式简单，易于培养，能用TAP液体培养基吹气培养，也能在平板上生长单克隆等优点而被选为模式生物，广泛用来研究光合作用，脂质代谢，纤毛运动，细胞分裂等过程。前人的研究也已经证明了衣藻的重要研究价值就是其简单的突变体获取方式，如 1930 年 Moiwus就已经能成功分离衣藻细胞的突变体。现如今更是可以通过电转的方法来高效快速获取大量突变体，并以此为基础来从中筛选感兴趣性状的突变体。

衣藻细胞周期调控涉及到衣藻纤毛去组装、释放中心体、形成纺锤体，以及后续的细胞分裂等的调控，每一个环节的缺陷都会造成周期的紊乱，从而影响其增殖。因此，在衣藻体系中，其纤毛周期与其细胞周期又是相互偶联的，因此为了探索纤毛周期的异样，可以以衣藻细胞周期异常的为突破口来对其进行深入性的研究。

多种其他种系的细胞作为研究细胞周期调控的报道很多，但是以衣藻作为实验材料来研究细胞周期调控缺陷，其自身具有很多优势：1. 衣藻在光照或者黑暗条件下均可生长，既可以异养又可以自养；2.衣藻属于单倍体，突变体的制备和筛选相对而言比较容易，可用各种筛选基因（如，aphVIII基因、ARG7基因、NIT1基因、ble基因等等）；3. 衣藻的细胞周期与纤毛周期相偶联，对于研究纤毛的研究者更加有实际意义；4. .衣藻基因组测序已全部完成并且不断更新，“Phytozome v12.1: Home”有衣藻基因组序列信息，方便突变体筛选后续的序列比对（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL）。

根据之前所报道的衣藻细胞浓度可以通过吸光值OD₄₃₄间接反映，发明人建立了本发明中衣藻细胞OD₄₃₄标准曲线。本发明通过发明人所建立的随机插入突变体文库，而后经过初筛根据单克隆直径大小，复筛再利用酶标仪OD₄₃₄检测细胞浓度，从而计算24 h与48 h的吸光值比值，从而参照野生型复制比，筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷的突变体的方法。该方法操作简便，效率较高，能够快速且稳定的获得细胞周期调控缺陷的突变体，为后续的实验打下了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定高效筛选和鉴定衣藻细胞周期调控缺陷突变体的方法。该方法可实现高效获得大量具有稳定遗传特性的衣藻突变体藻株，也验证了酶标仪可以通过测量两个时间点的衣藻细胞浓度，能够快捷的筛选和鉴定出细胞周期调控缺陷的衣藻，同时具备操作方法简便、易于推广应用、耗费时间短等优点。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种筛选莱茵衣藻周期调控缺陷突变体的方法，包括以下步骤：

步骤1，配制TAP液体培养基、TAP固体培养基、含巴龙霉素的TAP固体培养基，备用；

步骤2，将莱茵衣藻21gr接种于TAP液体培养基中，在22.5-23.5℃、8000 Lx光强下连续光照并通气培养，经过转接与继续培养、处理后，即可进行转化；