[发明专利]一种阴道上皮细胞分离培养方法

说明书

本发明公开了一种阴道上皮细胞分离培养方法。一种阴道上皮细胞分离培养方法，包含以下步骤：剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中，得到阴道上皮细胞。本发明首次通过含EDTA的胰酶和混合消化液对阴道组织进行二次消化分离得到阴道上皮细胞。通过优化的KSFM培养基培养阴道上皮细胞即可维持阴道上皮细胞的生长和扩增。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域,涉及一种阴道上皮细胞分离培养方法。

背景技术

先天性无阴道或阴道发育不全、盆腔廓清术后阴道缺如或狭窄等患者常需要阴道重建。组织工程阴道种子细胞的标准化制备是功能化阴道重建的前提。但自体阴道上皮细胞存在细胞难传代，易变异，且难以标准化推广的问题，因此，需要进一步摸索该细胞的分离培养及扩增技术。

目前阴道上皮细胞多采用分散酶消化过夜，剥离出上皮后，胰酶继续消化而获取。然后把分离的上皮细胞铺板，用上皮专用培养基KSFM进行培养。但是实际情况是，临床上可获取的人阴道组织很小和很碎，这样就难以进行分散酶分离上皮。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种阴道上皮细胞分离培养方法。

本发明的另一目的是提供一种阴道上皮细胞分离培养试剂盒。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种阴道上皮细胞分离培养方法，包含以下步骤：

(1)剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的消化液A为含0.01～0.04g/100ml EDTA的0.2～0.3g/100ml胰酶溶液；

(2)剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的混合消化液为含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100ml I型胶原酶和0.01～0.02g/100ml DNA酶的溶液；

(3)把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，得到阴道上皮细胞，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中进行培养和扩增。

作为本发明的一种优选实施方式，步骤(1)中消化液A为含0.02g/100ml EDTA的0.25％的胰酶溶液。

作为本发明的一种优选实施方式，步骤(1)中所述的组织剪碎至0.5～1.5mm³。

作为本发明的一种优选实施方式，步骤(1)中所述的混合消化液为含0.069g/100ml透明质酸酶、0.049g/100ml I型胶原酶和0.012g/100ml DNA酶的溶液。

作为本发明的一种优选实施方式，步骤(3)中所述的培养基为改良KSFM培养基。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的阴道上皮细胞分离培养方法还包含步骤(4)：将步骤(3)中分离获得的阴道上皮细胞在改良KSFM培养基上培养传代；所述的改良KSFM培养基为加入1～4％(v/v)FBS和4～5.5ng/ml bFGF的KSFM培养基。

作为本发明的一种优选实施方式，步骤(4)中所述的改良KSFM培养基为加入2％FBS和5ng/ml bFGF的KSFM培养基。

一种阴道上皮细胞分离培养试剂盒，包含：

(1)消化液A：含0.01～0.04g/100ml EDTA的0.2g/100ml～0.3g/100ml胰酶溶液；