[发明专利]一种用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤及其应用

权利要求书

1.一种用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤，其特征在于，该猪皮肤去除了猪免疫抗原GGTA，B4GAL和CAMH，并且带有人CD55,59,46,47,39,141,HLEA和TFPI蛋白组合;

抗原去除的方法为：

CAS9蛋白基因组水平敲除GGTA，B4Gal, CAMH基因，取猪皮肤成纤维细胞，用Neo转染系统，转染CAS9蛋白-引导RNA复合物；

采用全合一载体构建的方法敲入CD46, CD55, CD59, CD141, TFPI,CD39, CD47和HLAE，其具体方法为：

质粒制作按Golden Gate克隆法即II型限制性内切酶结合和切割回文序列进行；

先设计3个转录单位序列，每个转录单元含有一个启动子、一个编码序列和一个终止子，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开质粒DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的质粒，组建含有3个转录单位质粒，构建单一质粒或者构建3个不同质粒；同时设计第一转录单位序列：2841bp编码人补体负性蛋白CD55，CD59，CD46；第二转录单位序列：2531bp，编码人巨噬细胞负性蛋白CD47和人自然杀伤细胞负性调整蛋白HLAE；第三转录单位序列：5273bp, 编码人凝血负性蛋白CD141， CD39和组织因子通路抑制蛋白；通过设计三个转录单位序列包含CD46, CD55, CD59, CD141,TFPI,CD39, CD47和HLAE蛋白，接着采用Piggybac法基因组整合全合一载体。

2.如权利要求1所述的用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤，其特征在于，GGTA基因的引导RNA为：TCGTGACCATAACCAGA; B4GAL基因的引导RNA为AGGAAAGCTATAACTTGG；CMAH基因引导RNA为 AGAAACTCCTGAA CTACA 。

3.如权利要求1所述的用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤，其特征在于，所述CD55，CD59，CD46的序列表为：

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