[发明专利]一种用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤及其应用

说明书

本发明提供一种用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤及其应用，该猪皮肤去除了猪免疫抗原GGTA，B4GAL和CAMH，并且带有人CD55,59,46,47,39,141,HLEA和TFPI蛋白组合。得到的离体猪皮肤可以用于覆盖，封闭皮肤创面，并可以恢复创面有效血液循环和完整皮肤功能，可以挽救病人生命，促进创面修复，减少瘢痕形成，可以解决现有技术中皮肤创面移植猪皮肤无法成活的难题。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种用于人皮肤创面覆盖及修复的活性基因改造猪皮肤及其应用。

背景技术

创伤特别是大面积烧伤临床处理的难点在于初始时的创面的覆盖。目前的临床策略是早期清创和自体皮肤移植。然而大面积的烧伤创面常常没有足够的自体皮肤移植覆盖，必须用同种异体的人尸体皮肤或者人工合成的皮肤材料暂时覆盖，但这样的皮肤来源非常有限。另外，病情危重的严重创伤伴皮肤软组织缺损，早期扩创后往往不能耐受I期植皮手术，需暂时覆盖创面以延期植皮。目前临床上使用的猪皮覆盖物基本上是无活性的猪的真皮基质。而野生型猪全层皮肤覆盖恢复血供后会很快(3-4天之内)被超急性免疫排斥反应排斥，很快失去功能。

最近有研究表明单基因敲除半乳糖抗原的猪皮肤在非人灵长类皮肤移植模型上的覆盖效果和时间同同种异体移植相似，这项研究为创面的覆盖提供了新的思路，但单次覆盖时间不超过14天。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种基因改造的猪皮肤能有效克服上述困难。

具体步骤包括：

步骤(一)：抗原去除和人源性蛋白表达

1.CAS9蛋白基因组水平敲除GGTA，B4Gal,CAMH基因取猪皮肤成纤维细胞，用Neo转染系统(美国赛默飞公司)，转染CAS9蛋白-引导RNA复合物。其中，猪皮成纤维细胞源于6月内月龄的小型猪包括但不限于巴马猪，版纳猪，哥廷根猪等。cas9蛋白0.5-2微克，引导RNA为100-200微摩尔

其引导RNA的序列如下：

GGTA基因的引导RNA为：GTC GTGACCATAACCAGA；

B4GAL基因的引导RNA为AGGAAAGCTATAACTTGG；

CMAH基因引导RNA为AGAAACTCCTGAA CTACA。

其中，中靶细胞用人GGTA基因编码的isolectin B4糖蛋白磁珠分选后，用B4GAL和CAMH编码的糖蛋白抗体流式细胞仪分选，获得GGTA,B4GAL和CAMH基因三敲出细胞后行核转移后获得30天胚胎成纤维细胞进行下一步。

步骤(二)：全合一载体构建，如图1所示。

质粒制作按Golden Gate克隆法即II型限制性内切酶结合和切割回文序列(例如GGATCC)进行。先设计3个转录单位序列，每个转录单元含有一个启动子、一个编码序列和一个终止子，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开质粒DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的质粒，组建了含有3个转录单位质粒，可以构建单一质粒也可构建3个不同质粒。

具体步骤：含有上述序列的DNA序列从美国Integrated DNA technologies美国公司以gBlock形式购买(https://www.idtdna.com/site/order/gblockentry)，gblock按以下流程设计：5'-GCATCGTCTCATCGGTCTCACCCT转录单位AACGTGAGACCTGAGACGGCAT-3'；3'-CGTAGCAGAGTAGCCAGAGTAGGG转录单位CATAACTCTGGACTCTGCCGTA-5'。