[发明专利]人类免疫缺陷病毒1型耐药基因型检测法及试剂盒

说明书

本发明涉及人类免疫缺陷病毒1型耐药基因型检测法及试剂盒，属于分子生物技术领域。具体而言，本发明提供了用于检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV‑1)耐药基因型的引物组，用来扩增POL基因区的PR区(A区)和RT区(B区+C区)，包括RT‑PCR的引物、巢式PCR第2轮的引物、测序引物。还提供了高效检测HIV‑1耐药基因型的三段RT‑PCR方法以及试剂盒。与现有技术相比，本发明是在常规的in‑house一段法扩增基础上进行大量改进，重新设计引物和更改了相应的扩增反应体系和反应条件，容易掌握，特异性强，灵敏度也提高了很多。本发明的方法能够高效得扩增耐药分析的POL基因序列，这为更全面得耐药分析等提供了更加完善的重要的数据。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)PR和RT区耐药突变的引物组，一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)耐药基因型检测法(三段法PCR-测序法)及试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，会引起获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)即艾滋病。高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral treatment，HAART)又叫鸡尾酒疗法，通过三种或者三种以上的药物联合治疗HIV感染者，按其作用原理将抗病毒药物分为核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)、融合抑制剂(FIs)、共受体抑制剂(co-receptor inhibitors)和整合酶抑制剂(integraseinhibitors)。这些药物的联合使用有效降低了HIV感染相关疾病的发病率和死亡率，延长了HIV感染者寿命，但治疗中产生的毒株耐药性问题又成为抗病毒治疗失败的最主要原因。由于艾滋病病毒本身高速复制及复制过程中缺乏自我校对功能等原因，易发生基因突变产生耐药。同时，在长期抗病毒治疗药物选择性压力作用下，艾滋病病毒耐药突变几率大大增加。获得性(ADR)和传播性耐药性(TDR)都会增加治疗失败、艾滋病毒疾病进展的风险，以及需要更昂贵的二线和三线治疗方案。通过对患者体内毒株的基因型耐药分析结果，可以让医生帮助病人选择更合适的治疗方案。

RT-PCR-测序法是最常用的基因型耐药分析方法。RT-PCR扩增HIV-1的PR(Protease)基因区aa1-aa99和RT区(Reverse Transcriptase)aa20～aa230氨基酸位点，将扩增成功的基因片段进行测序，并将序列提交到斯坦福大学的HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/)。根据2014年WHO耐药监测指南推荐的12种监测药物中有≧1种耐药评分≧15，即判定为耐药。

所以PCR扩增基因序列成功是进行耐药分析的前提。如果病人的病毒载量较低或者实际操作中由于标本分散采集而集中检测，标本中HIV-1核酸质量下降，常常会出现扩增失败，无法获得病人体内的毒株耐药情况。

虽然国内外市场上也出现了一些商业化的检测试剂盒，但由于HIV-1变异大，基因亚型复杂，最终仅涵盖了中国主要的流行的几个毒株亚型，对一些重组型或者独特重组亚型或者新亚型无法检测到。

国内in-house的基因型耐药检测可以覆盖各个亚型的毒株。通常是巢式PCR法扩增耐药发生的POL基因区的大于1000bp片段。在扩增成功的情况可以完整的分析毒株的耐药情况。但由于扩增片段较长，并且HIV-1变异大，实际操作样本扩增成功率一般在80％多，抗病毒治疗中的样本的扩增成功率更低些。并且由于HIV-1变异大，HIV-1 database里每年新发现的CRFs在更新，而以往的in-house法中的常用引物却没有参考新的CRFs的信息进行更新，最终会导致引物很难结合到部分样本上导致扩增失败而无法获取基因型耐药分析结论。这对大样本调查研究中，将会有很多病人体内的毒株耐药情况无法获知。对个体在抗病毒治疗前的耐药检测数据缺失将导致无法指导临床医生制定精准的抗病毒治疗方案。

发明内容