[发明专利]一种间充质干细胞分泌素的制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于：具体的包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞接种在培养基中，进行恒温培养，温度在37℃，在24～48h后，能够获得培养好的间充质干细胞悬液，将培养好的间充质干细胞悬液放到间充质干细胞培养基液中混合均匀，转入生物反应器中通过培养液对干细胞进行培养，静置培养；

S2：生物反应器中培养2～5h后以30～50r/min的速度均匀搅拌1～2h，并在37℃的恒温状态下，内部气体含量为5％CO2和10％～20％O2的条件下培养10～20天，从而获得间充质干细胞基液，生物反应器内部环境压强恒定为一个标准大气压；

S3：在生物反应器中将S1所得的干细胞以磷酸缓冲液2～4次，然后向生物反应器中加入基础培养液DMDM/F12与磷酸缓冲液继续培养12～24h，收集生物反应器中的上清液，得到分泌素原液；

S4：获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后得滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中细胞培养基包括基础培养基DMDM/F12和添加剂:其中，添加剂为1～5mg/mL人白蛋白、40～60μg/mL维生素C和2～6mg/mL人参皂苷单体Rbl，在进行培养时，每过12个小时向着培养液的内部按照培养液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能够避免干细胞的分化。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于：所述S3中对干细胞进行清洗时，磷酸缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4，基础培养液DMDM/F12与磷酸缓冲液的体积比为1:4，磷酸盐缓冲液通过管道缓慢的通入生物反应器中，管道的侧壁与生物反应器内腔侧壁相贴合，管道的中液体的冲力使得生物反应器中的混合液旋转。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、皮肤、脐带血、脐带、胎盘中的一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌素的制备方法，其特征在于：所述S1采用的培养基为补充有10％胎牛血清和1％抗生素的改良Eagle培养基，即DMEM培养基。