[发明专利]一种间充质干细胞分泌素的制备方法

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞分泌素的制备方法，将间充质干细胞接种在培养基中，进行恒温培养，温度在37℃，在24～48h后，能够获得培养好的间充质干细胞悬液，将培养好的间充质干细胞悬液放到间充质干细胞培养基液中混合均匀，转入生物反应器中通过培养液对干细胞进行培养，静置培养通过向生物反应器中注入细胞培养基底液和磷酸盐缓冲液可以稀释生物反应器中的培养液,达到安全地持续刺激间充质干细胞细胞分泌蛋白的作用，从而能提高充质干细胞细胞分泌素的产量。

技术领域

本发明涉及分泌素的制备方法，尤其是涉及一种间充质干细胞分泌素的制备方法。

背景技术

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。

间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。虽然间充质干细胞分泌素的市场潜力很大,但是其大量培养存在较大的困难，主要表现为干细胞在生长时所需要较大的表面积，且干细胞非常容易分化，因此急需一种间充质干细胞分泌素的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种间充质干细胞分泌素的制备方法，从而解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种间充质干细胞分泌素的制备方法，具体的包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞接种在培养基中，进行恒温培养，温度在37℃，在 24～48h后，能够获得培养好的间充质干细胞悬液，将培养好的间充质干细胞悬液放到间充质干细胞培养基液中混合均匀，转入生物反应器中通过培养液对干细胞进行培养，静置培养；

S2：生物反应器中培养2～5h后以30～50r/min的速度均匀搅拌1～2h，并在37℃的恒温状态下，内部气体含量为5％CO2和10％～20％O2的条件下培养10～20天，从而获得间充质干细胞基液，生物反应器内部环境压强恒定为一个标准大气压；

S3：在生物反应器中将S1所得的干细胞以磷酸缓冲液2～4次，然后向生物反应器中加入基础培养液DMDM/F12与磷酸缓冲液继续培养12～24h，收集生物反应器中的上清液，得到分泌素原液；

S4：获得的间充质干细胞分泌素原液经70μm孔径细胞滤器过滤后得滤液，然后将滤液1500g速度离心10分钟，取上清液，上清液通过冷冻干燥制得冻干粉末，即获得间充质干细胞分泌素。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S3中细胞培养基包括基础培养基DMDM/F12和添加剂:其中，添加剂为1～5mg/mL人白蛋白、40～60μg/mL 维生素C和2～6mg/mL人参皂苷单体Rbl，在进行培养时，每过12个小时向着培养液的内部按照培养液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能够避免干细胞的分化。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S3中对干细胞进行清洗时，磷酸缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4，基础培养液DMDM/F12与磷酸缓冲液的体积比为1:4，磷酸盐缓冲液通过管道缓慢的通入生物反应器中，管道的侧壁与生物反应器内腔侧壁相贴合，管道的中液体的冲力使得生物反应器中的混合液旋转。