[发明专利]一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法

权利要求书

1.一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；

（2）洗涤PBMC：将步骤（1）所得PBMC细胞用基础培养基洗涤一次；

（3）调整PBMC细胞浓度：用所述基础细胞培养基对步骤（2）所得的PBMC的细胞浓度进行调整；

（4）培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用包被液包被处理1-2h后，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；

（5）第一次增殖培养：将步骤（3）所得PBMC置于步骤（4）所得T175细胞培养瓶中，并利用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；

（6）第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；

（7）第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；

（8）第四次增殖培养：将经过步骤（7）增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增殖培养基至500mL继续增殖培养；

（9）第五次增殖培养：每隔2-3d补加300-500mL的第五次增殖培养基300-500mL，第17-20d收获细胞。

2.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，步骤（3）中所得PBMC细胞浓度为1-2×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，步骤（4）中包被液为0.01-5.0mg/mL的CD3单克隆抗体和0.01-5.0mg/mL的CD16单克隆抗体的混合液。

4.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为ALys505N-0。

5.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，所述第一增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，灭活人体血清、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：5%-10%、500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。

6.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，所述第二增殖培养基和第三增殖培养基均是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。

7.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，所述第四增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分别为：500U/mL、10ng/mL、10ng/mL和10ng/mL。

8.根据权利要求1所述多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，其特征在于，所述第五增殖培养基是以ALys505N-0培养基为基础培养基，IL-2的含量为500U/mL。