[发明专利]一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体地说是一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法。一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，包括如下步骤：(1)获取PBMC；(2)洗涤PBMC；(3)调整PBMC细胞浓度；(4)培养瓶处理；(5)第一次增殖培养；(6)第二次增殖培养；(7)第三次增殖培养；(8)第四次增殖培养；(9)第五次增殖培养。本发明通过筛选多种细胞因子对NK细胞共同诱导培养，从流式检测结果可以看出CD3+CD56+含量比第0天提高了86.2％，NK细胞数量增加了150倍。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体地说是一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法。

背景技术

NK细胞，即自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体对抗病原体侵袭和正常细胞恶变的一种重要的天然免疫细胞，无需预先接触肿瘤特异性抗原即可杀伤肿瘤细胞，对肿瘤的增殖和转移扩散均具有“抑制”作用。NK细胞能够清除术后微小残留病灶，降低复发，因而被认为是肿瘤免疫治疗的重要免疫细胞。

NK细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，伤机制包括：FasL与Fas相互作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、肿瘤凋亡相关因子(TNF-α、IFN-β)的分泌作用。NK细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞可通过对粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。

有研究表明肿瘤患者外周血NK细胞的活性与其痊愈后存在着密切关系，然而，NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5-10％，且目前NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低，同时存在重复性差的缺点。

发明内容

发明提供了一种人细胞因子诱导的杀伤性细胞的培养方法，以克服目前NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低的问题。

本发明提供的技术方案为：

一种多细胞因子诱导的高纯度NK细胞培养方法，包括如下步骤：

(1)获取PBMC：取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；

(2)洗涤PBMC：将步骤(1)所得PBMC细胞用基础培养基洗涤一次；

(3)调整PBMC细胞浓度：用所述基础细胞培养基对步骤(2)所得的PBMC的细胞浓度进行调整；

(4)培养瓶处理：将T175细胞培养瓶用包被液包被处理1-2h后，倒出包被液并用生理盐水润洗一遍；

(5)第一次增殖培养：将步骤(3)所得PBMC置于步骤(4)所得T175细胞培养瓶中，并利用第一次增殖培养基增殖培养至第3d；

(6)第二次增殖培养：补加第0d一倍体积的第二次增殖培养基增殖培养至第5d；

(7)第三次增殖培养：补加第3d一倍体积的第三次增殖培养基增殖培养至第7d；

(8)第四次增殖培养：将经过步骤(7)增殖培养后的细胞转入培养袋中，补加第四次增殖培养基至500mL继续增殖培养；

(9)第五次增殖培养：每隔2-3d补加300-500mL的第五次增殖培养基300-500mL，第17-20d收获细胞。

作为优选，步骤(3)中所得PBMC细胞浓度为1-2×10⁶个/mL。

作为优选，步骤(4)中包被液为0.01-5.0mg/mL的CD3单克隆抗体和0.010-5.0mg/mL的CD16单克隆抗体的混合液。