[发明专利]一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光PCR引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供一种检测2019新型冠状病毒的双靶位点反转录荧光PCR引物、探针及试剂盒，通过对2019新型冠状病毒全基因组进行核酸序列比对，找到了该病毒N基因中3条特异性核酸序列W1、W2、W3，序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示，针对3个靶位点，分别设计多对引物探针，发现将针对W1和W2的靶点设计的引物探针组合(序列分别如SEQ ID NO.4‑6、SEQ ID NO.7‑9所示)进行双靶位点反转录荧光PCR，能够特异、灵敏地检测2019新型冠状病毒，检测灵敏度在10个拷贝以内，对临床常见22种呼吸道病原体均无非特异扩增，可有效避免单靶点突变造成的假阴性结果，具有良好的标本检测能力。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及用于检测2019新型冠状病毒的靶位点，针对靶位点的特异性引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行2019新型冠状病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)是2020年1月最新检测到的一种人致病性冠状病毒，引发不明原因肺炎疫情的呼吸道病原。临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，住院患者呼吸困难较为常见；绝大多数患者入院时生命体征大致平稳。该病毒虽未发现人与人之间的传染性，但仍然需要密切监测防止更大规模的感染。2020年1月11日至12日，该病毒的6组基因组序列信息公布，通过基因组序列对比，发现其序列与SARS 病毒较为相近，是SARS病毒的变异株，而6组基因序列中有冠状病毒N 基因上的变异。

检测病毒感染的传统手段为显微镜镜检、抗原检测。显微镜镜检涉及细胞培养，耗时较长，且需要一定的镜检技术经验；抗原检测大多基于ELISA，虽然能够快速得到检测结果，但灵敏度仍然较低。目前，病毒感染的检测主要依赖于核酸检测技术，如PCR、全基因组测序等，尤其是实时荧光PCR(qPCR)技术，具有极高的灵敏度和特异性，能够快速、准确的得到检测结果。目前，2019-nCoV感染无法通过特异性的临床症状进行识别诊断，核酸检测技术是其最重要的技术手段，通过快速的RT-qPCR技术，能够快速、准确地识别临床有疑似症状的检测者。可做到对2019-nCoV的快速检测，防止疫情扩散。

2019-nCoV归属为新型的SARS变异病毒，但目前尚没有经CFDA认证的商品化2019-nCoV核酸检测试剂盒，部分生物科技公司目前研发了针对2019-nCoV检测的科研用核酸检测试剂盒。但目前所有的2019-nCoV 核酸检测试剂盒均是基于传统RT-qPCR检测技术，其检测使用的引物探针均是针对单一的病原核酸序靶位点都设计的。众所周知，病毒的核酸序列变异程度高，其单碱基突变的频率约为10^-6，远高于细菌的10^-9。因此，针对病毒的核酸检测，单一靶位点容易产生由于突变导致假阴性检测结果，造成漏检。

发明内容

本发明目的在于建立一种具有高灵敏度和特异度的双靶位点 2019-nCoV检测的RT-qPCR方法、及用于该方法的特异性引物、探针和试剂盒。以弥补目前该新型冠状病毒核酸检测方法的空白；针对病毒核酸变异性高的特点，双靶位点的设计可极大的降低单一靶点对变异病毒的漏检情况。

本发明通过对6株2019新型冠状病毒(2019-nCoV)全基因测序和比对，发现了3段2019-nCoV的N基因上保守且具有种间特异性的核酸序列(W1-W3)，其序列分别如SEQ IDNO.1-3所示。本发明这对这 3个靶点涉及了多套相应的特异性引物探针组合用于分别检测3个靶点，在多套引物探针组合中，进一步筛选出4套检测效果优良的特异性引物探针组合，它们对靶位点的检测限达到了10-100拷贝。本发明进一步设计了针对该2019-nCoV病毒检测的双靶位点反转录荧光PCR (RT-qPCR)引物和探针，并由此进行检测的方法和试剂盒。

具体而言，第一方面，本发明首先提供了用于检测2019新型冠状病毒的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、和/或SEQ ID NO.2、和 /或SEQ ID NO.1所示。这3个特异性强的靶序列分别命名为W1、W2、 W3。