[发明专利]一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用。本发明以野生型人3型腺病毒衣壳蛋白六邻体基因为保护性抗原基因，以E1、E3区基因缺失的人5型复制缺陷型腺病毒为载体，以整合E1区基因的AD293细胞为包装细胞系。该复制缺陷型疫苗免疫小鼠后，可诱导机体产生较高的体液免疫，产生针对野生型人3型腺病毒的特异性中和性抗体，免疫途径为肌肉注射或滴鼻，该疫苗候选株具有制备方法简单、免疫操作简便、安全高效等优点，具备良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建 方法及应用。

背景技术

人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)是一种较常见的呼吸道系统感染病原体，传染性 强，可引起多系统多器官感染，易感人群主要为婴幼儿儿童，可引起急性呼吸道疾病(Acute Respiratory Disease，ARD)和婴幼儿致死性肺炎等重症病情，腺病毒肺炎是我国发病率最高 的一种病毒性肺炎之一。人腺病毒有51个血清型，其中人3型腺病毒为地方性、流行性和散 发性感染，在欧洲、亚洲、美洲和大洋洲均有报道，传染性强，具有强毒性并能导致严重的 临床症状例如重症肺炎甚至死亡。近年来，在我国腺病毒所造成的地方型流行频频暴发，主 要是以3型腺病毒等为主，针对腺病毒感染的预防和治疗已成为我国公共卫生事业亟待解决 的问题。

腺病毒是双链DNA病毒，基因组全长30-38kb，六邻体蛋白(hexon)是衣壳蛋白之一， 是刺激机体产生免疫保护性抗体、特异性抗体的最主要的蛋白。腺病毒感染后的治疗同其他 病毒所致疾病一样，目前并没有特异性的药物，只能对症治疗，主要靠机体自身免疫系统产 生的抗病毒性中和抗体消灭病毒从而使疾病痊愈。构建一株可以持续高水平表达六邻体蛋白 的重组病毒，刺激机体产生的保护性抗体可以预防同型腺病毒的感染。目前，世界上尚无人 3型腺病毒疫苗，研制开发价格低廉、安全有效、具有我国自主知识产权的腺病毒疫苗，对 今后我国3型腺病毒感染的防治十分重要，尤其是在人口密集、腺病毒经常暴发的城市进行 儿童疫苗接种，其经济效益和社会效益巨大，应用前景广阔。

人5型腺病毒为腺病毒中致病力最弱的病毒株，野生型病毒株也仅会偶致普通感冒；病 毒基因不整合到宿主细胞基因组中，无遗传毒性。该病毒载体经基因工程改造，调控病毒基 因早期复制的E1区缺失，致使病毒在感染普通细胞内不能复制其DNA，无法产生子代新病 毒，但可以转录表达蛋白；只对细胞实施一次感染，无环境污染，遗传背景清楚，安全性能 好，已经成为生物学、医学研究方面常用的工具。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建 方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，所述人3型腺病毒复制 缺陷型重组病毒以人5型复制缺陷型的腺病毒为载体，所述人5型复制缺陷型的腺病毒的基 因组缺失部分E1区和E3区基因，且在E1区位置插入了人3型腺病毒六邻体完整基因，并 在AD293细胞中包装得到重组病毒。

进一步地，所述人3型腺病毒六邻体完整基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。

一种如上述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法，包括：将含有人3型腺病 毒六邻体完整基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在细菌内同源重组，得到的重组腺病毒载体 在AD293细胞中包装获得该重组腺病毒疫苗；所述腺病毒骨架质粒为缺失部分E1区和E3 区基因的人5型腺病毒载体。

进一步地，包括：

将SEQ ID NO.3所示的3型腺病毒六邻体完整基因片段克隆至穿梭质粒，获得质粒pSAd3H；

将pSAd3H与人5型腺病毒载体骨架质粒转化入可表达重组酶的大肠杆菌，利用两质粒 同源臂进行同源重组，获得3型腺病毒重组载体prAd3H；