[发明专利]一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，该探针核苷酸序列为5’‑AGATGGTTCTGCTATCGCTTT‑3’；SEQ ID NO.1。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：解决了国外设计的禽类粪便污染物标记物无法在我国进行使用的现状，提供了一种适宜中国使用、灵敏度高、特异性好的禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针。本发明设计的探针灵敏度达到了86.55％，特异性达到了93.48％。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法。

背景技术

随着禽类养殖业的繁荣发展，禽类粪便的产生日益增加。部分粪便因雨水冲刷或人为管理不善，将会流入地表水中，对水体环境造成一定的污染。粪便中含有大量对人体有害的病原微生物，能够引起腹泻和急性肠胃炎等疾病。许多粪源病原体可以在体外环境水体中大量生长繁殖，从而导致病原微生物的水源性传播。如何快速鉴别水体中是否存在禽类粪便污染，对水体管理和保护具有重要的指导意义。

微生物溯源是根据源指示微生物与宿主之间所具有的特异性关系来定位污染源的一类溯源技术。微生物溯源技术以其客观性、低成本、检测速度快和结果准确等受到普遍关注。但是目前该项技术的应用存在地区差异性，这主要是两方面原因造成的：(1)宿主方面，由于不同地区的畜禽饲养方式往往存在一定差异，微生物在适应不同地区的宿主肠道环境的过程中可能产生遗传多样性，进而使得微生物溯源指示物的表型或基因型发生变异；(2)环境因素方面，由于指示物在不同环境条件下的衰减速率不一样，加之环境水体成分的复杂性，使微生物溯源技术在不同地区的适应性存在差异。目前，大多数禽类粪便污染标记物均是在国外发明的，故这些标记物不适合在中国使用。

因此，提供一种适宜中国使用、灵敏度高、特异性好的禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种禽类粪便污染荧光定量PCR检测探针，所述探针命名为AV4143P1，核苷酸序列为5’-AGATGGTTCTGCTATCGCTTT-3’；SEQ ID NO.1。

优选的，所述5’端使用6FAM作为荧光基团，所述3’端使用BHQ1作为淬灭基团。

一种检测水体中禽类粪便污染的方法，包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)采用荧光定量PCR方法进行检测；

反应体系如下：

10μL 2X TaqMan Environmental Master Mix 2.0(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)、终浓度为500nM的上游引物AV4143F、终浓度为500nM的下游引物AV4143R、终浓度为250nM的AV4143P1、2μL的DNA模板，加无菌水至20μL；

所述上游引物AV4143F的核苷酸序列为5’-TGCAAGTCGAACGAGGATTTCT-3’；SEQ IDNO.2；所述下游引物AV4143R的核苷酸序列为5’-TCACCTTGGTAGGCCGTTACC-3’；SEQ IDNO.3。

优选的，反应条件如下：

50℃预变性2min；95℃预变性10min；95℃变性15s；60℃退火和延伸1min，共40个循环。