[发明专利]一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法

权利要求书

1.一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将胎盘或脐带装入无菌容器中，无菌容器内保存液必须浸没过胎盘或脐带，密封容器并在4℃条件下8小时内运送回实验室；

步骤(2)：胎盘处理：使用已高压灭菌的手术剪去掉胎盘外膜，取内部暗红的组织块，使用含肝素钠的生理盐水洗净组织中的血液，最后使用生理盐水再清洗一遍；脐带处理：使用已高压灭菌的手术剪将脐带剪成约2cm/段，用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液，将脐带组织切成3.0~5.0mm³小块，生理盐水洗净；

步骤(3)：胎盘组织处理：胎盘组织使用混合酶消化法于37℃恒温水浴摇床中消化1-1.5h，消化完毕后，稀释过滤离心，选择性完全培养基重悬接种于相应数量的6孔板或一次性平皿中，放置培养箱中培养；脐带组织处理：加一滴选择性完全培养基润湿组织块，在37℃、5％CO ₂的培养箱中静置培养0.5-1h，然后，补加选择性完全培养基至没过组织块，放置培养箱中培养，所述混合酶为胰酶-EDTA和IV型胶原酶1∶1混合使用；

步骤(4)：待细胞汇合度达85％～95％时，即进行消化传代，传代至P3~P5更换为分泌培养基进行培养，待细胞汇合度达85％～95％时收集分泌液，细胞做冻存和鉴定处理；

步骤(5)：通过流式细胞仪进行细胞表面标记物鉴定；冻存前取少量细胞上清液进行无菌检测；

步骤(6)：将上述分泌液通过超滤系统进行浓缩，再过滤除菌得到间充质干细胞分泌原液备用，后续可做冻干处理得到间充质干细胞分泌物冻干粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)至(6)中所述的胎盘或脐带符合是健康产妇，足月婴儿，剖腹产等条件的胎盘或脐带方能收集使用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)至(6)中所述的组织块培养方法同时适用骨髓来源干细胞、脂肪来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)所述的含肝素钠的生理盐水为500ml生理盐水加入2支肝素钠，12500IU/支；

步骤(3)所述的稀释过滤离心，稀释为添加3-5倍生理盐水稀释，过滤为100μm孔径筛

过滤，离心为1600rpm、10min离心后去上清；

步骤(3)-（4）所述的培养均是置于5%CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养；

步骤(5)所述的细胞表面标记物鉴定应具有CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面标记表达呈阳性，而CD14、CD34、CD45及T或B淋巴细胞等表面标记表达均为阴性；

步骤(5)所述的无菌检测至少应做硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、血平板等接种培养检测；

步骤(6)所述的浓缩为采用截留分子量3KD的膜包进行超滤浓缩；

步骤(6)所述的过滤除菌为使用0.22μm的滤器进行过滤；

步骤(6)所述的分泌原液优先选择浓缩至步骤(4)得到的分泌液体积的1/10~1/15。

5.由权利要求1所述方法制备得到的间充质干细胞分泌物冻干粉在制备化妆品、保健品中应用。