[发明专利]一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物分析检测技术领域，尤其涉及一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用。本发明设计了有两条轨道的双链脱氧核糖核酸。轨道1以5’‑FAM和3’‑BHQ‑1为荧光探针，在5’‑FAM末端有2‑nt的突出结构。轨道2是一个带有5’‑PO4的ssDNA，该序列的大部分与探针互补，在5’‑PO4末端有0‑10nt的突出结构。没有碱性磷酸酶时，λexo选择与5’‑PO4末端结合并消化互补链，导致低荧光信号。当样品中有碱性磷酸酶时，轨道2中的5’‑PO4被转化为5’‑羟基；λexo选择与5’‑FAM末端结合并消化探针以离开FAM和BHQ‑1并发出强荧光信号。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，尤其涉及一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用。

背景技术

碱性磷酸酶是一种催化去磷酸化反应的酶。它广泛存在于肝、肠、肾、骨和胎盘等多种组织中。碱性磷酸酶的异常水平被证明与多种疾病高度相关，包括骨相关疾病、肝功能障碍、前列腺癌、乳腺癌和糖尿病。

迄今为止，已经开发了许多方法来定量碱性磷酸酶的酶活性，如比色法、表面增强拉曼散射法、色谱法、电化学法。然而，这些具有自身特点的方法不可避免地受到一些限制，例如灵敏度差、设计复杂和耗时过长。近年来，由于荧光分析具有灵敏度高、方便、仪器易得等特点，越来越多的人致力于研究碱性磷酸酶的荧光分析方法。然而，有些荧光分析方法的检出限仍不够令人满意，从1U/L到19U/L不等。一些研究人员开发了新的荧光分析方法，具有更好的效果。一类是利用量子点表面配体被碱性磷酸酶消化后发出荧光。检出限为0.0018U/L至0.07U/L。然而，量子点需要复杂的制备过程，不容易用于实际应用。另一类策略是使用磷酸基团标记的DNA来构建荧光传感器。碱性磷酸酶消化后，基团转化为羟基，引发下游反应。检测限范围从0.0002U/L到0.02U/L。然而，现有的方法都需要精心的实验设计和较长的检测时间。因此，临床应用迫切需要一种灵敏度高、设计简单、快速的碱性磷酸酶检测方法。

核酸外切酶(λexo)是一种具有5’-3’切割活性的核酸外切酶。它对具有或不具有5’磷酸基团的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)底物具有选择性。因此，λexo在一些工作中被用于碱性磷酸酶检测。然而，λexo对5’-PO4和5’-OH的选择性是有限的，即使在复杂的信号放大设计中，这些方法的LOD也只有0.01U/L至40U/L。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供的该方法利用λexo对于不同5’末端(5’-PO₄和5’-OH)具有不同亲和性，通过引入5’-FAM结构，结合碱性磷酸酶的去磷酸化的开关作用，构建了一种新的路径选择器来高灵敏度、简单、快速地检测碱性磷酸酶的活性

本发明是这样实现的，一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于，包括：

将去离子水、CutSmart缓冲液、λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的探针序列、含有5’-PO4的探针序列的互补链混合；

将混合液经85℃下升温和55℃下退火，冷却；

待冷却到37℃，加入λexo和待测样品，进行酶切反应，进行荧光检测。

进一步地，所述荧光基团为FAM荧光基团、HEX荧光基团或VIC荧光基团中的任一种。

所述荧光探针序列为FAM-TCTCCACAGACACATAC-BHQ。

进一步地，所述FAM荧光基团的5’-FAM末端有2-nt的突出结构。