[发明专利]基于CL7-CVN和Im7系统分离、富集和检测囊膜病毒的方法

说明书

本发明公开了一种基于CL7‑CVN和Im7系统分离、富集和检测囊膜病毒的方法，包括以下步骤：先制备重组CL7‑CVN蛋白和Im7蛋白；将Im7蛋白与微球偶联得到微球Im7‑Beads；先向待富集病毒样品中投入重组CL7‑CVN蛋白，孵育后，再投入Im7‑Beads，孵育后富集，离心得到富集病毒的Im7‑Beads；提取所述Im7‑Beads富集的囊膜病毒核酸，RT‑PCR检测并计算富集效率。本发明通过基因工程的方法制备了CL7‑CVN蛋白，并利用CL7与Im7的特异性结合、及CVN结合囊膜病毒的性能，能够将PRV病毒颗粒富集至Im7‑Beads表面，为病毒分离富集和其检测提供一种全新的技术手段。

技术领域

本发明属于生物技术应用领域和环境监测技术领域，具体涉及一种基于CL7-CVN和Im7系统分离、富集和检测囊膜病毒的方法。

背景技术

目前，如艾滋病病毒、单纯疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、伪狂犬病毒、非洲猪瘟、埃博拉病毒等囊膜病毒，已经给人类生存和发展制造了巨大的威胁，甚至灾难。现有囊膜病毒的分离诊断方法有很多，如病毒分离培养、PCR核酸检测、酶联免疫吸附测定等；然而，这些方法均存在操作复杂、费时，对技术要求高且价格昂贵，不利于快速和现场检测等缺点。因此建立一个简便快速、准确、高通量的诊断检测方法，对控制病毒暴发流行具有重要意义。

发明内容

Cyanovirin-N(简称CVN)是一种从蓝藻中分离得到的一种水溶性糖蛋白，能特异地、高亲和性地结合在囊膜病毒衣壳蛋白上阻止病毒感染入侵细胞，从而发挥抗病毒活性，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，同时它还具有抗病毒谱广、性质稳定等特点，这使得CVN蛋白成为一种很有价值的抗病毒药物，同时也为其成为分离检测囊膜病毒的方法成为可能。研究表明，CL7/Im7是目前发现的最强蛋白相互作用的1组蛋白(Kd为10^-14-10^-17M)。

本发明通过基因工程方法将CL7融合至CVN蛋白上，得到融合CL7标签的重组蛋白CL7-CVN。它既能够显著提高CVN可溶性表达水平，并且表达的CL7-CVN融合蛋白具有显著的抗病毒活性，而且重组CL7-CVN蛋白还能特异性地结合Im7蛋白。

根据通过CL7/Im7超高亲和系统，重组CL7-CVN能够同时特异地、高亲和性地结合囊膜病毒衣壳蛋白及和Im7。进一步地，将Im7结合至微球颗粒上，能够将溶液中病毒颗粒特异性地结合至微球颗粒表面，从而达到从溶液中分离病毒颗粒的效果，并以此建立了一个分离富集检测囊膜病毒检测方法。此方法具有灵敏度高、分离速度快、特异性强、操作简单、可重复性好，不需要昂贵的仪器设备等优点。

本发明提供的一种富集、分离和检测囊膜病毒的方法，其技术方案如下：

一种基于CL7-CVN和Im7系统分离和富集囊膜病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将CL7-CVN的表达载体转化至第一宿主细胞中，诱导表达，纯化后得到重组CL7-CVN蛋白；

(2)将Im7的表达载体转化至第二宿主细胞中，诱导表达，纯化后得到Im7蛋白；

(3)将Im7蛋白与微球偶联反应，得到Im7-Beads；

(4)先向待分离富集样品中投入重组CL7-CVN蛋白，孵育后，再投入Im7-Beads，孵育后富集，离心得到富集病毒的Im7-Beads。

一种检测囊膜病毒的方法，提取所述的Im7-Beads富集的囊膜病毒核酸，采用荧光定量PCR检测富集的病毒拷贝数，并计算囊膜病毒的富集效率。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：