[发明专利]使用低量总RNA的直接测序方法在审
| 申请号： | 202010058697.3 | 申请日： | 2020-01-19 |
| 公开（公告）号： | CN111187812A | 公开（公告）日： | 2020-05-22 |
| 发明（设计）人： | 姚斐 | 申请（专利权）人： | 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 37256 | 代理人： | 张洁 |
| 地址： | 266000 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 使用 低量总 rna 直接 方法 | ||
1.使用低量总RNA的直接测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；
利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。
2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。
3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。
4.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述起始总RNA进行反转录和扩增富集采用如下步骤：
在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；
所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；
所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。
5.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
6.根据权利要求5所述的测序方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应体系为：
起始总RNA 7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15μl。
7.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。
8.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第二次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
9.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于，所述第二次连接反应的反应体系为：
cDNA 20.0μl、连接反应缓冲液8.0μl、测序接头6.0μl、DNA连接酶3.0μl、无酶水3.0μl，共计40.0μl。
10.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的测序接头-cDNA的回收量。
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