[发明专利]使用低量总RNA的直接测序方法

说明书

本发明公开了一种使用低量总RNA的直接测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，包括以下步骤：微量样本总RNA的提取及其质量检测、起始总RNA的反转录和扩增富集、利用纳米孔测序仪进行RNA直接测序。本发明提供的测序方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，节约实验时间和成本，所需最低起始量的样本核酸量可低至1‑3μg，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用低量总RNA的直接测序方法。

背景技术

目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，因此依赖计算重构准确的异构体组装非常困难，同时短读长也表现出高比率的多重定位，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA直接测序的一种新的且更为有效的方式。

目前，RNA直接测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA直接测序的基本RNA量的需求，这无疑阻碍了RNA直接测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA直接测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA直接测序方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用低量总RNA的直接测序方法，该方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，而是直接使用总RNA进行测序的方法，同时对样本总RNA的需求量小，仅需要1-3μg的起始总RNA即可，能实现那些难以获得较大样本量样品的测序工作。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种使用低量总RNA的直接测序方法，所述方法包括以下步骤：

提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；

将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；

利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。

作为优选，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。

作为优选，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。

作为优选，所述起始总RNA进行扩增富集采用如下步骤：

在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；

所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；

所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。

作为优选，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。

作为优选，所述第一次连接反应的反应体系为：

起始总RNA 7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15.0μl。