[发明专利]一种辅助突变引物的设计方法及其应用

权利要求书

1.辅助突变引物的设计方法设计得到的引物组用于制备基因突变检测试剂盒的应用；

所述的辅助突变引物的设计方法，包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；

所述的辅助突变引物为F3、B3、FIP或BIP中的任意一条；突变的碱基为A、T、C和G四种碱基中除自身以外的其他三种碱基的任意一种：

F3-2和F3-3组合、F3-2和B3-3组合、F3-2和FIP-3组合、F3-2和BIP-3组合、B3-2和F3-3组合、B3-2和B3-3组合、B3-2和FIP-3组合、B3-2和BIP-3组合、FIP-2和F3-3组合、FIP-2和B3-3组合、FIP-2和FIP-3组合、FIP-2和BIP-3组合、BIP-2和F3-3组合、BIP-2和B3-3组合、BIP-2和FIP-3组合、BIP-2和BIP-3组合；

所述的F3-2包括A-CYP2C19*2-F3-W、A-CYP2C19*2-F3-M、A-CYP2C19*2-B3、A-CYP2C19*2-FIP、A-CYP2C19*2-BIP、A-CYP2C19*2-LF和A-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：

A-CYP2C19*2-F3-W:5’-CACTATCATTGATTATTTCC D G-3’；

A-CYP2C19*2-F3-M:5’-CACTATCATTGATTATTTCC D A-3’；

A-CYP2C19*2-B3:5’-GTAAACACAAAACTAGTCAATGA-3’；

A-CYP2C19*2-FIP:5’-CATCGATTCTTGGTGTTCTTTTCCATAACAAATTA CTTAAAAACCT-3’；

A-CYP2C19*2-BIP:5’-CCTCGGGACTTTATTGATTGCTCGCAAGCAGTCA CATAACTAA-3’；

A-CYP2C19*2-LF:5’-TCTCCAAAATATCACTTTCCATA-3’；

A-CYP2C19*2-LB:5’-GGAGAAGGTAAAATGTTAACAAA-3’；

A-CYP2C19*2-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，A-CYP2C19*2-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；

所述的F3-3包括A-CYP2C19*3-F3-W、A-CYP2C19*3-F3-M、A-CYP2C19*3-B3、A-CYP2C19*3-FIP、A-CYP2C19*3-BIP、A-CYP2C19*3-LF、A-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：

A-CYP2C19*3-F3-W:5’-GATTGTAAGCACCCCCT H G-3’；

A-CYP2C19*3-F3-M:5’-GATTGTAAGCACCCCCT HA-3’；

A-CYP2C19*3-B3:5’-CATTTCCTGTGCATAAAATAAAG-3’；

A-CYP2C19*3-FIP:5’-ATATAGAATTTTGGATTTCCCAGAACCAGGTAAG GCCAAGTTTTTT-3’；

A-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTTGCCATCTTTTC CAGATATTCA-3’；

A-CYP2C19*3-LF:5’-AGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3’；

A-CYP2C19*3-LB:5’-CAGTCTTGCCTAGACAGCC-3’；

A-CYP2C19*3-F3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，A-CYP2C19*3-F3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；

所述的B3-2包括B-CYP2C19*2-F3、B-CYP2C19*2-B3-W、B-CYP2C19*2-B3-M、B-CYP2C19*2-FIP、B-CYP2C19*2-BIP、B-CYP2C19*2-LF和B-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：

B-CYP2C19*2-F3：5’-CTCAAATCTTGTATAATCAGAGA-3’；

B-CYP2C19*2-B3-W：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTC D C-3’；

B-CYP2C19*2-B3-M：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTC D T-3’；

B-CYP2C19*2-FIP:5’-GCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAACTACACATGTAC AATAAAAATTTC-3’；

B-CYP2C19*2-BIP:5’-GTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTCAATGATAGT GGGAAAATTATTG-3’；

B-CYP2C19*2-LF：5’-TATAAATATAAATAAAATATATTGTATAT-3’；

B-CYP2C19*2-LB：5’-TAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGAT-3’；

B-CYP2C19*2-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，B-CYP2C19*2-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、T、G中的任意一个碱基；

所述的B3-3包括B-CYP2C19*3-F3、B-CYP2C19*3-B3-W、B-CYP2C19*3-B3-M、B-CYP2C19*3-FIP、B-CYP2C19*3-BIP、B-CYP2C19*3-LF、B-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：

B-CYP2C19*3-F3:5’-CTAATGTTTACTCATATTTTAAAATT-3’；

B-CYP2C19*3-B3-W:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAV C-3’；

B-CYP2C19*3-B3-M:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAV T-3’；

B-CYP2C19*3-FIP:5’-GAGCAGATCACATTGCAGGGACCAATCATTTAGC TTCACCCT-3’；

B-CYP2C19*3-BIP:5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAAGGTGCTTACA ATCCTGATGTT-3’；

B-CYP2C19*3-LF:5’-CAGCCCAGGATGAAAGTGG-3’；

B-CYP2C19*3-LB:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAAT-3’；

B-CYP2C19*3-B3-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，B-CYP2C19*3-B3-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基；

所述的FIP-2包括C-CYP2C19*2-F3、C-CYP2C19*2-B3、C-CYP2C19*2-FIP-W、C-CYP2C19*2-FIP-M、C-CYP2C19*2-BIP、C-CYP2C19*2-LF和C-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：

C-CYP2C19*2-F3:5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAAT-3’；

C-CYP2C19*2-B3:5’-CAGTCACATAACTAAGCTTTTG-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-W:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCAT TGATTATTTCC D G-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-M:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCAT TGATTATTTCC D A-3’；

C-CYP2C19*2-BIP:5’-ACACCAAGAATCGATGGACATCACCTTCTCCATT TTGATCAGG-3’；

C-CYP2C19*2-LF:5’-GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTA-3’；

C-CYP2C19*2-LB:5’-CTCGGGACTTTATTGATTGCT-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，C-CYP2C19*2-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；

所述的FIP-3包括C-CYP2C19*3-F3、C-CYP2C19*3-B3、C-CYP2C19*3-FIP-W、C-CYP2C19*3-FIP-M、C-CYP2C19*3-BIP、C-CYP2C19*3-LF和C-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：

C-CYP2C19*3-F3:5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACAT-3’；

C-CYP2C19*3-B3:5’-CCTGTGCATAAAATAAAGAACTT-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-W:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAA GCACCCCCT H G-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-M:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAA GCACCCCCT HA-3’；

C-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTCCATCTTTTCCA GATATTCACC-3’；

C-CYP2C19*3-LF:5’-GGAAGCAAAAAACTTGGCCTT-3’；

C-CYP2C19*3-LB:5’-CTACAGTCTTGCCTAGACAG-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，C-CYP2C19*3-FIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H为辅助突变碱基，为A、T、C中的任意一个碱基；

所述的BIP-2包括D-CYP2C19*2-F3、D-CYP2C19*2-B3、D-CYP2C19*2-FIP、D-CYP2C19*2-BIP-W、D-CYP2C19*2-BIP-M、D-CYP2C19*2-LF和D-CYP2C19*2-LB，其中各引物为：

D-CYP2C19*2-F3:5’-GAGAATTACTACACATGTACAAT-3’；

D-CYP2C19*2-B3:5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAA-3’；

D-CYP2C19*2-FIP:5’-GGTATAGATACAATATGCCAAGCTTCCCCATCAAG ATATACAATATA-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-W:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAA TTTGTTATGGGTTC DC-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-M:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAA TTTGTTATGGGTTC DT-3’；

D-CYP2C19*2-LF:5’-GGTTGTAATTTAAAACTATAAATATA-3’；

D-CYP2C19*2-LB:5’-GCAATAATTTTCCCACTATCATT-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*2-G的引物，D-CYP2C19*2-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D为辅助突变碱基，为A、G、T中的任意一个碱基；

所述的BIP-3包括D-CYP2C19*3-F3、D-CYP2C19*3-B3、D-CYP2C19*3-FIP、D-CYP2C19*3-BIP-W、D-CYP2C19*3-BIP-M、D-CYP2C19*3-LF和D-CYP2C19*3-LB，其中各引物为：

D-CYP2C19*3-F3：5’-TTCACCCTGTGATCCCACTT-3’；

D-CYP2C19*3-B3：5’-GTAAGTGGTTTCTCAGGAAGC-3’；

D-CYP2C19*3-FIP:5’-GCTGATCTTTATAATCGAAACGTTTCCTGGGCTGT GCTCCCT-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-W:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGG CCTTACCTGGAV C-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-M:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGG CCTTACCTGGAV T-3’；

D-CYP2C19*3-LF：5’-TGGAAAATAATGGAGCAGATCA-3’；

D-CYP2C19*3-LB：5’-AACATCAGGATTGTAAGCACC-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-W为检测野生型模板CYP2C19*3-G的引物，D-CYP2C19*3-BIP-M为检测突变型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基；

所述的试剂盒为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的试剂盒，所述的试剂盒包括如前所述的引物组、Bst DNA Polymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；

所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄和Tween-20；

所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl₂溶液的混合液；

所述的添加剂包括海藻糖和BSA；

所述的引物组每一组中的F3的浓度与B3的浓度相同，为0.8～1.6μmol/L；LF和LB的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；FIP与BIP的浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；

所述的Bst DNAPolymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；

所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH₄)₂SO₄为5～20mmol/L、MgSO₄为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％；

所述的SYBR Green I浓度为1×～5×；所述的Calcein和MnCl₂的混合液中，Calcein溶液浓度为10～30μmol/L，MnCl₂溶液的为500μmol/L；

所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml。