[发明专利]一种辅助突变引物的设计方法及其应用

说明书

本发明公开了一种辅助突变引物的设计方法及其应用，该设计方法包括以下过程：利用LAMP技术，将待测碱基位于引物的3’端，然后人为突变待测碱基相邻位置的碱基，获得辅助突变引物；从而使DNA聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了Bst DNAP olymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；使用该方法设计CYP2C19*2和CYP2C19*3基因检测的引物组，并将该引物组用于制备基因突变检测试剂盒。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种辅助突变引物的设计方法及其应用。

背景技术

CYP2C19基因定位于人类10号染色体长臂第24区，基因长度约90.21Kb，含9个外显子和8个内含子，可编码由490个氨基酸组成的功能蛋白。CYP2C19基因具有高度的多态性，目前已经发现的有CYP2C19*2、*3、*4、*6、*9、*10、*17等多个突变等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3是中国人群中最主要的等位基因型。CYP2C19*2等位基因突变是指CYP2C19基因第5外显子681GA突变，该突变引起转录过程中一段碱基序列的丢失，导致CYP2C19酶活降低。CYP2C19*3等位基因突变是CYP2C19基因第4外显子636GA突变，该突变导致原本的色氨酸密码子突变为终止密码子，导致CYP2C19酶的合成提前终止。因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3的突变均会导致CYP2C19酶活性的降低或丧失，导致其代谢底物的能力减弱，从而引起相关药物代谢速率的个体化差异。

在人体中，CYP2C19参与的药物代谢主要包括：氯吡格雷、苯妥英、伏立康唑和安定等。氯吡格雷是一种前体药物，必须经过肝细胞色素P450酶(CYP450)代谢为活性物质，才能发挥其抗血小板聚集的作用。由于CYP2C19的基因多态性，患者对氯吡格雷的代谢能力也呈现个体化差异，弱代谢能力服用氯吡格雷则不能达到应有的疗效。因此，美国FDA建议在用药前对患者进行CYP2C19基因分型是非常必要的，对氯吡格雷弱代谢型患者建议采用其他抗凝血药物。苯妥英一种临床上常用的抗癫痫药，研究表明苯妥英的代谢能力与CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型密切相关。伏立康唑是一种广普型抗真菌药物，其代谢途径同样受CYP2C19调控，美国FDA批准的药物说明书中特别指出，在使用伏立康唑前需要对CYP2C19基因进行基因型检测，以确保安全用药。人体内60％的安定是通过N-去甲基代谢途径生成去甲安定，这一过程主要受CYP2C19和CYP3A调控。

综上所述，CYP2C19基因型的确定在多种药物选择或剂量确定方面具有非常显著的意义。然而目前CYP2C19基因型的检测多采用PCR荧光探针法、PCR毛细管电泳分析法和焦磷酸测序法等，普遍具有价格昂贵、耗时长、操作繁琐、对操作人员技能要求较高等不足，无法在基层医疗单位进行推广。环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)由于其对检测设备的要求较低，操作简便，以及高灵敏度，目前已经广泛应用于病原微生物的检测中。近年来也研究报道利用LAMP法检测基因突变，但仍存在较为明显的不足。如专利文献CN 105861690 A利用肽核酸(PNA)制备的探针与DNA或RNA能够形成稳定的复合体，而单碱基突变能够引起该复合体较大Tm值变化的原理，与LAMP技术结合。但目前肽核酸合成技术仍不成熟，合成的PNA纯度一般仅能达到90％-95％，同时，肽核酸合成成本较高，合成50nmol的费用高达5000-6000元左右，检测费用高。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种辅助突变引物的设计方法，并使用该方法对CYP2C19-2和CYP2C19-3基因检测的引物组进行设计，将所得的引物组用于制备基因突变检测的试剂盒，解决现有的基因突变检测技术检测耗时长、费用高、设备依赖度高等问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：