[发明专利]特异性检测HTLV-II前病毒DNA的引物及其应用

说明书

本发明公开了特异性检测HTLV‑II前病毒DNA的引物和荧光探针，以及检测样本中HTLV‑II前病毒DNA的TaqMan qPCR和微滴式数字PCR(ddPCR)方法，可用于定性或定量检测样本中的HTLV‑II前病毒DNA。

技术领域

本发明属于分子生物检测领域，更具体涉及对HTLV-II前病毒DNA的检测。

背景技术

HTLV-II病毒，是人类T淋巴细胞白血病病毒(Human T-cell Lymphotropicvirus,HTLV)的一种，也被称为人嗜T淋巴病毒II型于1982年首次从多毛细胞白血病患者中分离得到[1]。HTLV-II属于逆转录病毒科肿瘤病毒亚科哺乳类C型病毒，基因组全长8.95kb，电镜下呈球形颗粒，直径约为80～130nm。

人嗜T淋巴病毒II型(HTLV-II)和人嗜T淋巴病毒I型(HTLV-I)是密切相关的逆转录病毒，且具有相似的基因组结构，共有约60～70％的核苷酸序列同源[2]。由于它们与肿瘤形成、神经病理学、转化原发性人类T淋巴细胞的能力有关，近年来一直在进行深入研究。

HTLV-II和HTLV-I具有相似的生物学特性和常见的传播方式，在体外均可有效地使T淋巴细胞转化和永生化，并可在受感染的动物体内存活。然而这两种病毒的临床表现却存在显著差异，HTLV-I能引起多种疾病，如成人T细胞白血病(ATL)[3,4]、热带痉挛性下肢瘫(TSP)[5]和多发硬化症(MS)、不明原因的脉管炎(KW)等。相比之下，HTLV-II的致病性要低得多，只有少数病例报告为变异型毛细胞白血病和与神经系统感染性疾病。此外，HTLV-II感染还与偶发性的类HAM/TSP的脊髓病病例有关[6-8]，但与淋巴增生性疾病的发展无明确关系。迄今为止，显示携带HTLV-Ⅱ与特定疾病相关的个体数量有限，因此无法在流行病学上令人信服地证明HTLV-II在人类疾病中的确切病因作用。

HTLV-II主要在北美和西欧静脉注射吸毒者中流行[9-11]，并且在一些美洲印第安人和非洲侏儒部落中也可以发现地方性感染[12-14]。与HTLV-Ⅰ的多种传播途径相似，HTLV-II也可通过受感染的血液、精液、阴道液、直肠分泌物、母乳和器官移植传播，但主要方式是通过静脉注射传播。现有的HTLV-II的检测方法包括外周血或骨髓细胞学检查、血清HTLV-II抗体检测、病毒颗粒及抗原检测和脑脊液检查等，但这些方法操作繁琐，灵敏性和特异性不高，容易出现假阳性。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术的发展实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且其特异性强、灵敏度高、检测方法简便快速、能有效检测出低拷贝的目的DNA片段。

qPCR技术有两种方法：染料法和TaqMan探针法。染料法如SYBR GreenⅠ染料可与双链DNA的小沟结合，当被激发后可以产生荧光信号，但由于任何双链都可以与其非特异性结合产生非特异性信号，因此会造成不准确的结果。TaqMan探针法的探针具有5’端荧光报告基团和3’端淬灭基团，完整的探针受到激发光后会发生荧光共振能量转移，因此检测不到信号；只有当DNA复制时，探针被水解，报告基团和淬灭基团分离，才可以检测到荧光，因此荧光信号的强弱就代表了模板的数量，由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。虽然 SYBR Green和TaqMan技术在扩增效率上差别不是很大[15]，但TaqMan技术因为特异性更高、敏感性更强，更适用于微量模板的检测和定量[16]。

随着PCR技术的发展，第三代PCR技术—数字PCR实现了样品的绝对定量。它可以避过标准品的使用，利用有限稀释、终点PCR和泊松分布实现核酸浓度的直接定量 [17]。基于微滴的数字PCR—微滴式数字PCR(ddPCR)可以实现痕量核酸的高灵敏检测，灵敏度可达单个核酸分子；并具有优秀的准确度、精密度和重复性[18]，能够有效区分浓度差异微小的样品。

实时荧光定量PCR和数字PCR对引物的要求较高，特别是对非特异性反应和引物二聚体要求严格。