[发明专利]一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法

权利要求书

1.一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法包括以下步骤：

步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运输；

步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉淀层；以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细胞；

步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清；过滤上清液，收集滤液备用；

步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清：以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X10⁷/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养；

步骤五，制备CM-透明质酸混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠剂和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA；将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用；

步骤六，流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上清；以PBS重悬沉淀，上机检测；

步骤七，利用ELISA法检测A-CM中生物活性分子。

2.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述ADSCs培养具体包括：

(1)无菌条件下小心剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的医用生理盐水重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，小心吸弃表面油脂，收集脂肪层和沉淀层；

(2)以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，37度水浴，190r/min，震荡消化30分钟；吸弃上层油脂、悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清；

(3)以生理盐水洗涤2次，以ADSCs完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5X10⁵/mL，接种至175cm²组织培养瓶中，饱和湿度，5％CO₂，37℃培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收获；

(4)收获时吸弃培养上清，以生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；收集细胞悬液，400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；

(5)传代时，以ADSCs完全培养基重悬P0代细胞，按10000细胞/cm²接种，隔夜完全换液，培养至90％以上融合时收获，记为P1代ADSCs；继续传代至P2代时收获。

3.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心速率设定升速9降速1，离心时间为30min；收集上清后，以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。

4.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述制备无培养基ADSCs培养上清的方法具体包括：

以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X10⁷/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中，饱和湿度，5％CO₂，37℃培养；收集接种后24h、48h、72h的细胞悬液各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清；以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。