[发明专利]一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法

说明书

本发明涉及一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法，通过控制发酵体系pH、温度、DO值、葡萄糖浓度和添加外源添加物达到提高提高两性霉素B产量的目的。本发明分阶段发酵调控策略能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，有利于两性霉素B的积累；同时补料调控则通过补料培养基和外源化合物的补料，避免了营养物质在发酵过程中的消耗，后期得不到必要的补充的问题。采用本发明发酵方法，两性霉素B放罐单位可以达到16g/L以上，生产成本较目前的先进水平降低15％左右，所得两性霉素B发酵液中，副产物两性霉素A下降了30％以上，降低了后期分离纯化的难度。

(一)技术领域

本发明涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。

(二)背景技术

两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是重要的抗真菌类抗生素，自1966年上市以来，一直是深部真菌感染的首选药物。AmB纯品的颜色为黄色或橘黄色，由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点，使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。AmB抗真菌谱广、活性强，对念珠菌、隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都有很强的抗真菌作用，还能有效抑制假丝酵母菌和用于治疗利什曼病等，因此两性霉素B及其衍生物的应用仍然非常广泛。

目前两性霉素B的工业生产仍主要采用的是微生物发酵法，微生物发酵生产抗生素的水平高低除了与菌种遗传特性有关，还与发酵培养基成分和发酵条件及发酵过程控制有关。对于前者目前有诱变育种和分子改造等手段，对于后者主要通过优化得到最适发酵培养基配方、发酵培养条件，同时通过发酵过程控制及补料可实现抗生素的提产，尤其是与发酵调控结合下补料分批发酵能够更有利于抗生素产量的提高。

补料可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响，改善发酵流变学的性质；可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。AmB发酵属于好氧过程，结节链霉菌在发酵过程中存在葡萄糖流加速率与溶氧控制相关联的问题。如果葡萄糖流加过快，则会导致溶氧水平过低，使发酵处于厌氧状态，目标产物产量降低；如果葡萄糖流加过慢，则会导致溶氧水平过高，菌体处于饥饿状态，自溶现象增加，影响目标产物的产生。目前，两性霉素B仍存在产量较低，产业化生产发展缓慢的问题限制了两性霉素B的发展。因此，开拓出一条新的提高两性霉素B的产量的方法，对实际应用具有很大意义。

(三)发明内容

本发明的目的是针对上述存在的缺陷而提供一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法。

本发明采用的技术方案是：

一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法，所述方法包括：将结节链霉菌接种至种子培养基，获得种子液；种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，发酵总时间120±36小时(较佳的为132±12小时)，发酵过程中参数控制如下：

(1)控制发酵体系pH维持在6.0～7.5，直至发酵结束；

(2)在发酵培养第0～48h，维持温度在30±3℃，当发酵至48h时，将温度降至26±3℃，维持该温度直至发酵结束；

(3)发酵前期使菌体在自然DO条件下生长，当发酵体系DO值下降至5～50％时，控制DO值维持在5％～50％至第108h，后恢复自然DO值直至发酵结束；

(4)控制发酵培养基中葡萄糖浓度，发酵过程中葡糖糖浓度下降到20～40g/L时，进行恒速补料，葡糖糖补料速率为0.1～5.0g/L·h；所用的发酵罐可为上海保兴生物BIOTECH系列的5L发酵罐；每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。补料培养基为：100～500g/L葡萄糖，1～20g/L蛋白胨和0.01～5g/L硫酸铵，溶剂为水；