[发明专利]一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法

权利要求书

1.一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、采集齿叶冬青的未成熟种子，清洗消毒后，剥出幼胚作为外植体备用；

步骤2、将所得幼胚接种至愈伤组织诱导培养基上培养，获得胚性愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基的配方为：1/4MS+0～0.1mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L2，4-D；

步骤3、将所得胚性愈伤组织转移至增殖培养基上增殖培养，所述增殖培养基的配方为：WPM+1mg/L ZT或者1～2mg/L2-ip+0.5～4mg/L 2，4-D+30～60g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺；

步骤4、增殖培养后转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，所述体胚诱导培养基的配方为：WPM+1.0mg/L ZT或者1～2mg/L2-ip+0.5～4mg/L 2，4-D+60～90g/L蔗糖+5～7mg/LABA+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺培养基上；

步骤5、将所得的体细胞胚转移至MS培养基上萌发培养，然后转移至光照条件下培养至形成生根的完整植株；

步骤6、将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中培养。

2.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤1中清洗消毒的具体步骤为：将冬青的未成熟种子用流水冲洗10～30min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；种子的表面消毒先用75％的酒精浸泡5～30min，再用8％次氯酸钠浸泡10～30min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌水中待用。

3.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤2中培养条件为：培养的温度为25±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16～18h/d。

4.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤2中愈伤组织诱导培养基的配方为：1/4MS+0～0.1mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D。

5.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤3中增殖培养基的配方为：WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺。

6.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤3中增殖培养的条件为：培养的温度为25±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16～18h/d。

7.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤4中体胚诱导培养基的配方为：WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/L2，4-D+60g/L蔗糖+6mg/LABA+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺。

8.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤5中MS培养基上萌发12～16d后转移至光照条件下培养26～30d，所述光照条件下的光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16～18h/d。

9.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤6中移栽至栽培基质中置于温室苗床上喷雾系统下生长。