[发明专利]一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法

说明书

本发明公开了一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，包括：将齿叶冬青的幼胚接种至1/4MS+0～0.1mg/L6‑BA+0.5～1.5mg/L 2，4‑D培养基上培养，获得胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转至WPM+1mg/L ZT或1～2mg/L2‑ip+0.5～4mg/L 2，4‑D+30～60g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺培养基上增殖培养；转至WPM+1.0mg/L ZT或1～2mg/L2‑ip+0.5～4mg/L 2，4‑D+60～90g/L蔗糖+5～7mg/LABA+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺培养基上培养获得体细胞胚后继续培养。

技术领域

本发明涉及组培技术领域，特别涉及一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法。

背景技术

齿叶冬青是多枝常绿灌木，高可达5米；叶片革质，倒卵形，椭圆形或长圆状椭圆形，雄花1-7朵排成聚伞花序，花4基数，白色；花萼盘状，花瓣4，阔椭圆形，花冠直径约6毫米，花瓣卵形，子房卵球形，果球形，成熟后黑色；内果皮革质。花期5-6月，果期8-10月。生于海拔700-2100米的丘陵，山地杂木林或灌木丛中。分布于中国、日本和朝鲜。常栽培作庭园观赏树种，欧美各地亦有栽培。齿叶冬青果实属植物种子，发芽十分困难，由于坚硬的种皮和未成熟合子胚的双重休眠，使其具有隔年发芽的特性。齿叶冬青常规育种需要2-3年才能获得幼苗。

目前，国内外有关以子叶、下胚轴、叶片、芽(嫩芽和休眠芽)等为外植体，通过器官发生途径获得了试管苗，但普遍存在着但普遍存在着外植体褐变严重、愈伤组织诱导率低、繁殖系数低、体细胞胚诱导难等一系列技术问题，阻碍了齿叶冬青工厂化育苗和优良无性系在生产上的大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，以齿叶冬青幼苗幼胚作为外植体，通过体细胞胚胎间接发生方式成功获得植株再生快繁体系，齿叶冬青愈伤组织诱导率与体细胞胚诱导率均较高且褐化率低、繁殖系数高。

本发明是这样实现的：

本发明的目的在于提供一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法，所述方法包括：

步骤1、采集齿叶冬青的未成熟种子，清洗消毒后，剥出幼胚作为外植体备用；

步骤2、将所得幼胚接种至愈伤组织诱导培养基上培养，获得胚性愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基的配方为：1/4MS+0～0.1mg/L6-BA+0.5～1.5mg/L 2，4-D；

步骤3、将所得胚性愈伤组织转移至增殖培养基上增殖培养，所述增殖培养基的配方为：WPM+1mg/L ZT或者1～2mg/L2-ip+0.5～4mg/L 2，4-D+30～60g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺；

步骤4、增值培养后转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，所述体胚诱导培养基的配方为：WPM+1.0mg/L ZT或者1～2mg/L2-ip+0.5～4mg/L 2，4-D+60～90g/L蔗糖+5～7mg/L ABA+6～7g/L琼脂+480～520mg/L谷氨酰胺培养基上；

步骤5、将所得的体细胞胚转移至MS培养基上萌发培养一段时间后，转移至光照条件下培养一段时间形成生根的完整植株；

步骤6、将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中培养。

优选地，所述步骤1中清洗消毒的具体步骤为：将冬青的未成熟种子用流水冲洗10～30min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；种子的表面消毒先用75％的酒精浸泡5～30min，再用8％次氯酸钠浸泡10～30min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌水中待用。

优选地，所述步骤2中培养条件为：培养的温度为25±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16～18h/d。