[发明专利]广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用

权利要求书

1.抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），免疫原的制备：以纯化的EV71和CA16病毒为免疫原；

步骤（2），动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以2周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量免疫原充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的免疫原，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

步骤（3），杂交瘤细胞株的制备和筛选：将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后10-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，首次免疫注射量为50ul 10⁷TCID50/ml EV71和 50ul10⁷TCID50/ml CA16；

步骤（3）中，将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，具体方法为：

选择6～8周龄Balb/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞；取处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤（2）免疫小鼠脾脏细胞按照1∶10的细胞数量比例进行混和，采用聚乙二醇4000进行细胞融合，细胞融合后获得的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的培养板中，使用含有1×HAT选择性培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养；

还包括杂交瘤细胞的克隆化，具体是：通过有限稀释法对杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，连续培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养并冻存。

3.广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用权利要求1~2任意一项所述的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的制备方法制得的抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株；包括如下步骤：

提取抗EV71、CA16、CA10和CA6广谱中和抗体杂交瘤细胞株的RNA，逆转录获取cDNA；然后巢式PCR扩增抗体重链可变区，同时巢式PCR扩增抗体轻链可变区；之后采用PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体对抗体20-IgM可变区进行连接，获取IgM型抗体；同时，采用PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体对抗体20-IgM可变区进行连接，获取IgG型抗体；接着将连接得到的阳性单克隆抗体转染至CHO-S细胞，后纯化，即得广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体和IgG型单克隆抗体；所述的PVITRO1-hygro-mcs-IgM/κ连接载体的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述的PVITRO1-hygro-mcsIgG/κ连接载体的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。

4.采用权利要求3所述的广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体的制备方法制备得到的抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合广谱中和IgM型单克隆抗体以及其IgG型单克隆抗体。

5.一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。