[发明专利]广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用

说明书

本发明涉及一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人‑鼠嵌合IgM型单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。本发明获得了一种可以同时抗EV71、CA16、CA 10和CA6的人‑鼠嵌合单克隆抗体，其由鼠源抗体IgM的可变区和人源抗体IgM的恒定区构成。本发明所述嵌合抗体对EV71、CA16、CA10和CA6均具有较高亲和力，对EV71、CA16、CA10和CA6展现广谱高效的中和活力，可用于治疗EV71、CA16、CA10和CA6等A型肠道病毒引起的手足口病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

肠道病毒71(Enterovirus 71，EV71)与柯萨奇病毒A型16(Coxsackievirus A 16，CA16)已被鉴定是诱发手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原体。近年来，研究显示：柯萨奇病毒A型10(Coxsackievirus A 10，CA10)和柯萨奇病毒A型6(Coxsackievirus A 16，CA6)感染导致手足口病病例呈现上升趋势。目前，已经成功上市的灭活EV71疫苗针对EV71感染展现高效的保护效果，但其对CA16、CA10与CA6等其他型别肠道病毒没有交叉保护作用。同时，研究显示：在CA16疫苗免疫恒河猴后，其所产生的中和抗体不能有效保护宿主抵抗病毒感染。由此，开发针对肠道病毒具有广谱高效的中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)进行被动免疫的病毒防治已成为抗病毒的新策略之一。目前报道的单克隆抗体为IgG型，其仅对单一型别的肠道病毒具有中和治疗效应，且不具有交叉保护作用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6人-鼠嵌合IgM型单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明采用杂交瘤法制备得到一株鼠源的单克隆抗体，但由于其可能引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应，影响其在人体内的治疗效果并产生副反应。因此，本发明利用人-鼠嵌合法将该株鼠源抗体进行修饰改造，降低其对人体的免疫原性。人-鼠嵌合抗体是利用基因工程技术将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区相连接，构建成嵌合抗体，可以保持原有抗体的亲和力和特异性，减少人抗鼠抗体反应，延长半衰期和改善药代动力学。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，免疫原的制备：以纯化的EV71和CA16病毒为免疫原；

步骤(2)，动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以2周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量免疫原充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的免疫原，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；

步骤(3)，杂交瘤细胞株的制备和筛选：将处于对数生长期的SP2/0细胞与步骤(2)免疫小鼠脾脏细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后10-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌广谱中和抗EV71、CA16、CA10和CA6抗体的杂交瘤细胞株。

进一步，优选的是，步骤(2)中，首次免疫注射量为50ul 10⁷TCID50/ml EV71和50ul 10⁷TCID50/ml CA16。