[发明专利]检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及病菌检测技术领域，具体公开一种检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。所述引物和探针的序列为：上游引物：5′‑TGAGTAACACGTACCTAACCT ACCTTTTGGAC‑3′；下游引物：5′‑TGCTGCCTCC CGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTC‑3′；所述探针的序列为：5′‑TTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGACGATGAT‑THF‑TTTAGCGGGGCCAAGAG‑3′。本发明引物和探针的组合用于对绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA检测，兼具特异性高、敏感性好、准确性高以及耗时短的优点。

技术领域

本发明涉及病菌检测技术领域，尤其涉及一种检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma Ovipneumoniae，MO)是引起绵羊支原体肺炎 (又称绵羊传染性胸膜肺炎)的一种慢性呼吸道传染病的病原，可使绵羊、山羊、大角羊和野生小反刍动物患呼吸道传染疾病，主要危害1-3月龄的羔羊，是一种传染性强、发病率高、死亡率高的接触性传染病。临床上主要表现为咳嗽、喘息、生育率低下、肺间质增生、慢性消耗导致体重下降。MO引发的疾病及继发感染逐步成为养羊业的重大隐患；绵羊肺炎支原体同时对山羊也有致病性，可引起山羊发生传染性胸膜肺炎。目前，绵羊肺炎支原体病原分离鉴定是确诊该病的首要证据，但其病原对营养要求苛刻，分离培养困难，其在羊群中的发病率为20-30％，个别的地区高达60-80％，死亡率15-30％。因此，早期、快速和有效诊断是预防和控制MO疫情所必须的重要手段。

重组酶介导链替换核酸扩增方法(recombinase-aided amplification，RAA) 是一种新型等温核酸扩增技术，可短时间内完成扩增，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RAA 结果的监测。若能建立MO的RAA检测方法，则对绵羊传染性胸膜肺炎的早期预防和针对性治疗具有重要意义。

发明内容

针对现有绵羊肺炎支原体(Mo)的检测方法存在检测方法复杂、耗时长、检测条件要求苛刻及检测效率低的问题，本发明提供一种检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-TGAGTAACACGTACCTAACCTACCTTTTGGAC-3′；

下游引物：5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTC-3′；

所述探针的序列为：5′-TTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGACGATGAT- THF-TTTAGCGGGGCCAAGAG-3′。

优选的，所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。

优选的，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为5′–TTGGTAGGGTAAAGGC CTACCAAGACGATGA/FAM-dT/-THF-/BHQ1-dT/TTAGCGGGGCCAAGAG-C3 -sapcer-3′。

本发明还提供一种检测绵羊肺炎支原体的实时荧光RAA试剂盒。该试剂盒包含上述引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA冻干粉和去离子水。