[发明专利]一种具有抑制巨噬细胞分泌NO功能的蛹虫草多糖及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种具有抑制巨噬细胞分泌NO功能的蛹虫草多糖的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将蛹虫草菌种接种于液体培养基中进行发酵培养，固液分离，得到蛹虫草发酵液和蛹虫草菌丝体；

(2)将步骤(1)中得到的蛹虫草菌丝体烘干、粉碎过筛，得到菌丝体粉末；然后加入石油醚进行脱脂处理，烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；

(3)将步骤(2)中得到的蛹虫草菌丝体干粉加入到水中，于65～95℃条件下进行热水浸提，得到蛹虫草浸提液；然后将蛹虫草浸提液浓缩，得到蛹虫草浸提浓缩液；

(4)将步骤(3)中得到的蛹虫草浸提浓缩液和步骤(1)中得到的蛹虫草发酵液分别采用胰蛋白酶结合Sevage法除蛋白，依次得到除蛋白后的胞内粗多糖提取液和胞外粗多糖提取液；

(5)将步骤(4)中得到胞内粗多糖提取液和胞外粗多糖提取液分别加入到乙醇溶液中，静置，离心收集沉淀，再分别加水复溶，得到胞内粗多糖溶液和胞外多糖溶液；再进行脱色，透析、浓缩、干燥，分别得到IPCM和EPCM；

(6)将步骤(5)中得到的IPCM和EPCM进行DEAE-纤维素柱层析纯化，然后透析，冷冻干燥，得到IPCM-1和EPCM-1；即为所述的具有抑制巨噬细胞分泌NO功能的蛹虫草多糖；其中，DEAE-纤维素柱层析采用pH 7.2、含0.4mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液洗脱IPCM，采用pH8.0、含1mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液洗脱EPCM。

2.根据权利要求1所述的具有抑制巨噬细胞分泌NO功能的蛹虫草多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(6)中所述的DEAE-纤维素柱层析通过如下步骤实现：

S1、装柱：往层析柱中加入1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-纤维素填料倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积为柱体积的2/3；

S2、平衡：利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液泵入到层析柱内，打开下端出液口，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同；

S3、上样和洗脱：

S31、将IPCM溶解于pH 8.0Tris-HCL中，离心，取上清，得到IPCM溶液；然后将IPCM溶液加入层析柱中，再用pH 7.2、含0.4mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液洗脱，收集蛹虫草胞内多糖；以苯酚硫酸法测定蛹虫草胞内多糖总糖含量，合并单一吸收峰样品，透析，浓缩，冷冻干燥，得到IPCM-1；

S32、将EPCM溶解于pH 8.2Tris-HCL缓冲液中，离心，取上清，得到EPCM溶液；然后将EPCM溶液加入层析柱中，再用pH 8.0、含1mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液洗脱，收集蛹虫草胞外多糖；以苯酚硫酸法测定蛹虫草胞内多糖总糖含量，合并单一吸收峰样品，透析，浓缩，冷冻干燥，得到EPCM-1。

3.根据权利要求2所述的具有抑制巨噬细胞分泌NO功能的蛹虫草多糖的制备方法，其特征在于：

步骤S1中所述的层析柱的规格为：3.0cm×80cm；

步骤S2中所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～7.6；

步骤S2中所述的流出液的流速为1mL/min；

步骤S31中所述的IPCM溶液的浓度为10～15mg/mL；

步骤S31和步骤S32中离心的条件为：5000～8000rpm离心10min；

步骤S32中所述的EPCM溶液的浓度为10～15mg/mL；

步骤S31和步骤S32中所述的洗脱的流速为1mL/min。