[发明专利]对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，包括：一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如下所示：

SHIV-F：CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC；

SHIV-R：CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG；

SHIV-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUGCCUAUGGGAUCGAAU；

SHIV-P：Fam-TTATT-BHQ1。

2.一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒，包括CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组如权利要求1所示。

3.如权利要求2所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒，其特征在于，还包括：RPA反应液，CRISPR-Cas12a蛋白酶缓冲液，CRISPR-Cas12a蛋白酶，RNA酶抑制剂，阳性对照和阴性对照；

所述RPA反应液由RPA Buffer，20×Core reaction，10×E-Mix和280mM醋酸镁组成；

所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒CMP基因片段的T载体；

所述阴性对照为超纯水。

4.如权利要求1所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或权利要求2～3所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒在快速鉴定对虾虹彩病毒中的应用。

5.一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)利用权利要求1所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或权利要求2所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒对步骤(1)获得的待检样品的DNA依次进行重组酶聚合酶等温扩增反应和CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，并根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。

6.如权利要求5所述的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，其特征在于，

所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应体系为：总体积为25μl；

其中，10μM SHIV-F 1μl；10μM SHIV-R 1μl；RPA Buffer 12.5μl；20×core reaction1.25μL；10×E-Mix 2.5μL；280mM MgOAc 1.25μl，待检DNA 1～100ng，超纯水补齐到25μL；

所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应体系为：总体积为20μl；

其中，10×Fncas12a Bufffer 2.5μl；10μM Fncas12a酶1μl；10μM crRNA 2μl；5U/μLRNase抑制剂1μl；10μM SHIV-P 1μl；重组酶聚合酶等温扩增反应的扩增产物1μL；超纯水补齐至20μL。

7.如权利要求5所述的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应条件为：37℃反应10～20min；所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应程序为：37℃预变性1s，37℃变性45s，37℃退火、延伸15s，循环40次。

8.如权利要求5所述的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，其特征在于，所述判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，如果出现扩增曲线则判定为阳性；如果无扩增曲线，则判定为阴性。