[发明专利]对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种对虾虹彩病毒的CRISPR‑Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法，该引物组包括一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR‑Cas12a蛋白酶等温检测引物组及其试剂盒，能够特异性识别对虾虹彩病毒CMP基因的特异性序列，故其特异性和灵敏度极高，最低检测极限可达到0.1ag/μL，且非常稳定，能够有效的避免非特异性扩增而产生的假阳性，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

虹彩病毒(简写为SHIV)属于虹彩病毒科，是一种二十面体对称的胞浆型、双链DNA病毒，该病毒的宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。而感染该病毒会造成虾的造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，主要的症状是游水，趴边，身体微红，肝胰腺萎缩以及空肠空胃。

对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的SHIV病原检测方法是减少虹彩病发生和危害的重要途径。

目前，对于对虾是否感染虹彩病毒的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。

近年来，Recombinase Polymerase Amplification(RPA)技术和基因编辑技术的出现为其带来了一种更简便灵敏的检测方式，这是一种在恒温下可以快速检测的方法。在该方法中首先重组酶在37℃恒温条件下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，然后利用Cas12a酶在crRNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA。在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，如果Cas12a识别到靶序列的存在，就会切割单链探针底物从而释放荧光报告基团。

目前，关于对虾虹彩病毒的检测试剂盒的报道还较少，仅有采用RAA技术检测虾虹彩病毒的专利文献，即：申请公布号为CN107988428A发明专利申请公开了一种虾虹彩病毒(SIV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，而采用RPA反应体系检测虾虹彩病毒的也较少，采用基因编辑技术的则未见报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，该引物组的敏度高、特异性高且稳定性好，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

本发明的第二目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒同样也具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

本发明的第三目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，该方法能够快速高效地进行扩增，不仅操作简便，而且鉴定也更为简便。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，包括：一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如下所示：

SHIV-F：CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC(如SEQ ID NO.1所示)；