[发明专利]一种同时检测CYP2C9和VKORC1基因的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因‑1639 GA位点的试剂盒及其应用，可同时检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因‑1639 GA位点的多态性，成本低廉，结果直观，能作为血液抗凝治疗者服用华法林的初始剂量和维持剂量的参考。本发明可结合INR检测值调整维持剂量，能显著降低华法林用药的副反应和风险。

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种用于检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因-1639GA位点的试剂盒及其应用。

背景技术

CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9参与体内多种药物的羟化代谢。CYP2C9基因具有遗传多态性，人类最常见的等位基因有3种，即野生型CYP2C9*1及突变型CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)，2种突变型等位基因均可导致CYP2C9酶活性降低，其中CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。CYP2C9*2等位基因在亚洲和中国汉族人群中罕见。CYP2C9*3等位基因在中国人群中的频率约为3％。CYP2C9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。

华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。华法林由S-和R-两种消旋体构成，其中S-华法林的抗凝活性约为R-华法林的5倍。85％以上的S-华法林在体内经CYP2C9代谢为无活性的代谢产物，CYP2C9*3纯合子和杂合子基因型个体S-华法林的口服清除率分别下降90％和66％，因此华法林的给药剂量需相应降低。美国FDA推荐在使用华法林前进行CYP2C9基因检测。测定CYP2C9*3等位基因可用于指导中国人群确定华法林的起始用药剂量，并预测药物毒性，结合国际标准化比值(International normalized ratio，INR)检测值，估计华法林的维持剂量，确保用药安全。

维生素K环氧化物还原酶是华法林抗凝作用的靶点，它是维生素K依赖性凝血因子生成过程中的限速酶，其阻碍维生素K由环氧化物形式转化成氢醌形式，从而阻断凝血因子的活化从而产生抗凝作用。维生素K环氧化物还原酶复合物1的编码基因VKORC1(vitamin Kepoxide reductase complex subunit 1)启动子区(-1639GA)的单核苷酸突变-1639GA可影响VKORC1的表达，从而影响华法林的敏感性，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639GA和GG基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，VKORC1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。VKORC1-1639A等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。

目前用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的方法包括PCR-Sanger测序法、PCR-焦磷酸测序法、等位基因特异性PCR法、荧光PCR法、PCR-高分辨率熔解曲线法、PCR-基因芯片法、PCR-限制性片段长度多态性方法等。

PCR-Sanger测序法先进行PCR扩增，获得跨越靶位点的PCR产物，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。它是基因多态性位点检测的金标准。但对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢。