[发明专利]血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种从血清中分离纯化载脂蛋白A‑II的方法，包括利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A‑II成分进行初步提纯，用不含盐的缓冲液洗杂，用含有有机醇的缓冲液洗脱并收集含A‑II载脂蛋白的洗脱液，以及利用阴离子交换层析填料对收集的含A‑II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯，用含有去污剂和有机醇的缓冲液对载脂蛋白A‑II进行柱上脱脂等步骤。本方法仅通过2步层析即得到纯度≥95％的载脂蛋白A‑II，回收率≥50％。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种载脂蛋白AII的分离纯化方法。

背景技术

ApoAⅡ是HDL中含量第二多的载脂蛋白，早在1985年ApoAⅡ蛋白质的氨基酸序列、cDNA序列及基因序列均已阐明。ApoAⅡ在人血清中以二聚体的形式存在，其单体分子量为8700Da。人ApoAⅡ蛋白C端氨基酸残基为谷氨酸，N端为吡咯烷酮酸，缺乏组氨酸，精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多态性存在，最主要的多态型等电点为4.9，而含量较少的多态型的等电点为5.17、4.68、4.42和4.20。

ApoAⅡ的生理功能是：

1、维持HDL结构。ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有与磷脂的结合能力，经二级结构分析认为，残基17-30和51-62形成的双性螺旋结构是人ApoAⅡ与脂质结合的分子基础。

2、激活肝脂酶。用以水解CM和VLDL中的TG和PL。还有报道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。ApoAⅡ由肝脏和小肠合成。人血浆中的ApoAⅡ生物半寿期为4.4天。

目前已知提取血清载脂蛋白A-II方法比较少，主要为超速离心法后用Scanu(1971)法脱脂。此方法制备载脂蛋白A-II的缺陷包括：1)成本高，对设备要求高；2)制备规模小；3)有机试剂脱脂容易导致样品失活等。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清载脂蛋白A-II的纯化方法，它具有步骤简单，制备规模易放大，样品不易失活的特点。

本发明所采用的技术方案是：

血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，包括有以下步骤：

1)利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A-II成分进行初步提纯，用不含盐的缓冲液洗杂，用含有有机醇的缓冲液洗脱并收集含A-II载脂蛋白的洗脱液；

2)利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯，用含有去污剂和有机醇的缓冲液对载脂蛋白A-II进行柱上脱脂。

所述步骤1)中，疏水层析填料为Phenyl Sepharose High Performance。

所述步骤1)中，疏水层析初步提纯的过程包括平衡、上样、洗杂、洗脱。

所述步骤1)中，不含盐的缓冲液为pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述步骤1)中，含有有机醇的缓冲液为30—50％的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述步骤2)中，阴离子交换层析填料为Q Sephrose HP。

所述步骤2)中，利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯过程包括平衡、上样、脱脂、再平衡、洗脱。

所述步骤2)中，含有去污剂和有机醇的缓冲液为含有0.5％的去污剂，30—50％的有机醇的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述去污剂为曲拉通X-100和聚多卡醇(Thesit)。

所述有机醇为乙二醇。