[发明专利]一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法

权利要求书

1.一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取土壤样品总模板DNA并测定DNA浓度，稀释制成待测土壤模板DNA溶液；

2)提取射纹革菌的菌丝中总DNA并测定DNA浓度，制备成标准曲线模板DNA溶液；

3)将标准曲线模板DNA溶液或待测土壤模板DNA溶液分别进行qPCR反应体系构建，所述qPCR反应体系包括针对常见土壤真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列为5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列为5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I为次黄嘌呤碱基；

4)对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应；

5)以标准曲线模板DNA溶液中的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线：y＝ax+b，其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；

6)计算待测土壤模板DNA溶液的目标特异性片段总拷贝数N(copy)＝10^(Ct-b)/a，式中Ct为待测土壤模板DNA溶液测定的具体循环数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；

7)计算土壤样品每克干土的真菌数量＝(c*V*N)/(c_r*V_r*m)，单位为copy/g；式中c为土壤样品总模板DNA浓度，单位为ng/μL；c_r为待测土壤模板DNA溶液的浓度，单位为ng/μL；V为土壤样品总模板DNA的体积，单位为μL，V_r为待测土壤模板DNA溶液的体积，单位为μL；m为用于提取总模板DNA的土壤样品干重，单位为g。

2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤1)具体为：称取0.3g过2mm筛的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤样品总DNA并溶于灭菌双蒸水中，测定DNA浓度，并将浓度统一稀释到4-6ng/μL，作为待测土壤模板DNA溶液。

3.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤2)具体为：将22℃下180rpm震荡马铃薯液体培养基培养生长2天的射纹革菌的菌丝倒扣在已灭菌的纱布上，拧干菌丝水分后于液氮中研磨成粉末；利用CTAB法提取0.2g所述粉末的总DNA，将所述总DNA溶于灭菌双蒸水中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定其DNA浓度，制备标准曲线模板DNA溶液。

4.根据权利要求3所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，所述制备标准曲线模板DNA溶液的具体方法为：利用已知的射纹革菌基因组碱基数40.92Mb和质量4.48432×10^-5ng及其目标特异性片段拷贝数5个/基因组，计算出标准曲线模板DNA母液中的目标特异性片段拷贝浓度，单位为copy/μL；取适量母液加入灭菌双蒸水调节目标特异性片段拷贝浓度至10⁸copy/5μL；取10μL 10⁸copy/5μL模板DNA溶液加入灭菌双蒸水依次稀释为10⁷copy/5μL，10⁶copy/5μL，10⁵copy/5μL，10⁴copy/5μL，10³copy/5μL的标准曲线模板DNA溶液，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列。

5.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤3)中所述qPCR反应体系构建的方法具体为：在96孔荧光定量板上，依次加入标准曲线模板DNA溶液/待测土壤模板DNA溶液5μL，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用灭菌双蒸水将反应体系调节至20μL；用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀。

6.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤4)具体为：利用ABI7500实时荧光定量PCR仪对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应，反应步骤为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火+延伸1min，45个循环。