[发明专利]一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法

说明书

本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，属于土壤真菌数量检测领域。本发明公开的方法主要包括：称取过筛的新鲜土壤，利用试剂盒提取土壤总DNA，统一稀释到一定浓度；将生长适度的模板射纹革菌的菌丝利用CTAB法提取总DNA，制备成标准曲线系列模板DNA溶液；将标准曲线或待测土壤模板DNA溶液构建qPCR反应体系，包括根据真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物；利用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应；绘制出标准曲线；计算每克干土中真菌数量。本发明提供的检测土壤真菌数量的方法，操作安全简便，引物序列特异性好，灵敏度高，结果精准可靠，重现性好。

技术领域

本发明属于土壤真菌数量检测领域，更具体地说，涉及一种基于实时荧光定量PCR(qPCR)检测土壤真菌数量的方法。

背景技术

真菌在农业和森林土壤生态系统中占有重要地位，每克土壤中真菌数目达到几千万个，根际土壤中真菌数目更是达到100倍之多。研究表明，真菌是连接土壤和植物之间的重要纽带，与植物的生长息息相关。一方面真菌是有机质降解的主要微生物，其分泌的降解酶类是土壤养分转化和能量流动的重要保障，另一方面真菌分泌植物促生或有害物质，增强植物抗病能力或诱导植物感病。同时，真菌也是土壤微生物的主要组分，全球土壤真菌生物量碳约为12Gt(吨)，是土壤细菌(7Gt)的两倍，更是远远超过土壤动物(2Gt)和古细菌(0.5Gt)。由于区域内生物细胞的总丰度决定了土壤中有机质周转率的上限，因此，土壤真菌的数量一定程度上反映土壤群落的基线功能潜力，是评价土壤微生物群落结构、土壤肥力高低和土壤结构改良的可靠指标。同时，由于真菌数量受到土地利用方式、植物群落结构、气候条件和土壤理化性质等众多因素影响。因此，提供一种简单迅速、可批量操作和结果精准的真菌数量检测方法具有重要的意义。

土壤真菌的数量一定程度上反映土壤群落的基线功能潜力，是评价土壤微生物群落结构、土壤肥力高低和土壤结构改良的可靠指标。但我国土壤真菌数量测定方法采用稀释平板法、琼脂膜法、麦角甾醇换算法和几丁质换算法等方法，但存在着方法粗放烦琐、与国际先进方法脱轨以及实验设备落后等诸多问题。以稀释平板法为例，由于全世界已知的真菌种类总数高达510万种，远远超过最初估计的150万种，但其中只有8万种真菌可以人工培养，因此平板培养法局限性很大，不能获得真菌数量的可靠信息；麦角甾醇和几丁质换算法是基于真菌常见而特有的物质来估算土壤真菌的数量，方法虽简单易行，但是特异性差，数据精准度较低；还有利用实时荧光定量PCR测定某一类特殊生理功能真菌，如发明专利201610473539.8，公开了基于实时荧光定量PCR检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，该方法灵敏度虽高，但并不能表征土壤真菌整体数量。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，包括如下步骤：

1)提取土壤样品总模板DNA并测定DNA浓度，稀释制成待测土壤模板DNA溶液；

2)提取射纹革菌的菌丝中总DNA并测定DNA浓度，制备成标准曲线模板DNA溶液；

3)将标准曲线模板DNA溶液或待测土壤模板DNA溶液分别进行qPCR反应体系构建，所述qPCR反应体系包括针对常见土壤真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列为5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列为5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I为次黄嘌呤碱基；

4)对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应；