[发明专利]一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系、制备方法及其应用，属于分子细胞生物学技术领域。本发明中用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到特异性靶向维生素K循环的小分子抑制剂。本发明通过对Maybridge Hit Finder小分子化合物库进行筛选，筛选到21种抑制维生素K循环的小分子化合物，在这21种化合物中，有已知是VKOR蛋白抑制剂的小分子，更进一步证明了该体系筛选的有效性。本发明的双报告基因细胞体系解决了现有方法无法高通量筛选靶向维生素K循环的小分子抑制剂的问题，为开发特异性靶向维生素K循环的新型抗凝血药物提供了技术指导。

技术领域

本发明涉及一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系、制备方法及其应用，属于分子细胞生物学技术领域。

背景技术

维生素K在血液正常凝固中发挥重要作用，主要用于防止新生婴儿出血疾病、预防内出血以及维生素K拮抗剂的解毒剂。维生素K通过调节一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻译后修饰参与凝血。维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化修饰是其发挥凝血功能的必要条件。维生素K在这一翻译后修饰过程中发挥核心作用，并以三种形式在体内循环，分别是维生素K环氧化物(KO)、维生素K(K)和二氢维生素K(KH₂)。

目前已知两个酶在维生素K循环中发挥作用。其中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)利用KH₂为辅因子，对维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基进行γ羧基化修饰，同时把KH₂转化成KO。为了使GGCX的催化反应可以持续进行，KO必须被还原成KH₂，而这一反应主要是由具有KO还原酶活性和K还原酶活性的维生素K环氧化物还原酶(VKOR)催化的。VKOR催化KO到K，以及K到KH₂，使维生素K可以循环利用。研究表明，VKOR是临床抗凝血药物华法林(warfarin)的特异性作用靶点，华法林通过抑制VKOR的活性，使KO不能转化为K和KH₂，从而阻断了维生素K循环，进而抑制凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基的γ羧基化修饰，达到抗凝血的目的。此外，杀鼠药溴敌隆也是特异性靶向VKOR的抑制剂。

维生素K循环的关键酶VKOR和GGCX都是开发抗凝血药物(或杀鼠药)的重要靶点。然而目前还没有针对这两个靶点筛选小分子抑制剂的体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系，该体系可以快速对药物小分子库进行高通量筛选从而得到特异性靶向维生素K循环的小分子抑制剂。

同时，本发明还提供一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系的制备方法。

最后，本发明还提供一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系在筛选特异性靶向维生素K循环的小分子抑制剂方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系，所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中用于筛选维生素K循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到特异性靶向维生素K循环的小分子抑制剂。本发明的双报告基因细胞体系解决了现有方法无法高通量筛选靶向维生素K循环的小分子抑制剂的技术问题，为开发特异性靶向维生素K循环的新型抗凝血药物提供了技术指导。

所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex(invitrogen)。