[发明专利]用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体及制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体，包括具有与PD‑L1配体结合的结构域、MUC16单链抗体、铰链区、跨膜域和胞内域。在本发明中，PD1‑antimuc16 CAR‑T细胞对构建的各种OVCAR3细胞均有较高的杀伤活性。PD1‑antimuc16 CAR‑T细胞相较于没有CAR的T细胞与各种靶细胞接触后IL‑2、IFN‑γ和TNF‑α三种因子的释放量均显著增加。PD1‑antimuc16 CAR‑T细胞在动物实验中表现出了极优异的对卵巢癌OVCAR3细胞的治疗作用，肿瘤杀伤及抑制效果显著，而且小鼠生存率高，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种用于治疗卵巢癌的嵌合抗原受体，同时涉及相应的制备方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，也是女性第五大最常见的恶性肿瘤。由于其早期无特异性表现，仅为超声等影像学异常，故约70％的患者发现时已至中晚期阶段。目前，卵巢癌的治疗以手术治疗联合化学治疗为主，据研究显示五年生存率不到40％，甚至可低至20％。为改善卵巢癌的预后情况，急需进一步探索更有效的治疗方法。目前，过继性免疫治疗被认为是一种具有靶向性和个体化的免疫治疗方法，在转移性黑色素瘤的治疗中已取得突破性进展。其中非常具有代表性的是嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigenreceptor T cell,简称为CAR-T)治疗技术，该技术主要功能是胞外段识别肿瘤细胞上特异性表达的抗原，经铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内域将信号转化为活化信号，激活T细胞进行增殖释放细胞因子和穿孔素等杀伤肿瘤细胞。CAR-T技术已在血液肿瘤中取得明显进展。

目前在采用CAR-T技术治疗卵巢癌的相关研究中，普遍采用单一靶点或双靶点，即选定一种或两种肿瘤过表达抗原作为靶点，构建相应配体的CAR-T细胞，特异性识别具有抗原的细胞作为攻击目标，常用的靶抗原有FSHR、EpCAM及MSLN。CAR-T治疗实体瘤技术的缺陷是(1)免疫逃逸，因为抗原表达量的降低或缺失，CAR-T细胞无法正常识别靶细胞造成靶细胞免疫逃逸。(2)易出现脱靶，CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也存在一定杀伤性。(3)免疫抑制。程序性死亡受体1(programmed cell death-1，简称为PD-1)与其配体PD-L1(programmed cell death-ligand 1，简称为PD-L1)组成的PD-1/PD-L1信号通路是最典型的T细胞免疫抑制。PD-1是一种表达于活化的T细胞、B细胞、抗原提呈细胞及巨噬细胞表面的免疫共抑制分子，属于CD28/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，简称为CTLA-4)家族。但选择PD-1作为CAR-T靶点也存在技术问题，在实验中发现卵巢癌特异性抗原连接含有PD-1的靶点构建的CAR-T细胞治疗效果并不理想甚至是无效。

如何得到一种CAR-T嵌合抗原受体，以期在治疗中有效减少T细胞脱靶、提高细胞因子释放水平并避免免疫逃逸以得到良好的治疗效果，仍然是本领域技术人员研究的热点。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种对卵巢癌细胞具有明显杀伤作用，有效避免治疗中T细胞免疫逃逸、脱靶及肿瘤细胞免疫抑制发生的嵌合抗原受体。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述嵌合抗原受体的制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体，包括具有与PD-L1配体结合的结构域、MUC16单链抗体、铰链区、跨膜域和胞内域；其中，

所述与PD-L1配体结合的结构域为PD-1etco，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID No.1所示序列功能的衍生序列；