[发明专利]一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/SaCas9系统能够特异性抑制HBV复制的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的靶点核苷酸序列如SEQ ID NO：4或5所示。

2.一种含有SaCas9肝脏特异性启动子组合和权利要求1所述gRNA分子的CRISPR/SaCas9系统，其特征在于，所述SaCas9肝脏特异性启动子组合为核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的Enh2-PPck或Enh2-Pa1AT，所述CRISPR/SaCas9系统以PX601为表达载体，用SaCas9肝脏特异性启动子组合对表达载体的CMV启动子进行替换得到替换了启动子的PX601表达载体，将权利要求1所述gRNA分子与替换了启动子的PX601表达载体相连接。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/SaCas9系统，其特征在于，所述将权利要求1所述gRNA分子与替换了启动子的PX601表达载体相连接为先在所述gRNA分子的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

N表示A、G、C和T，将双链DNA片段和用BbsI酶切过的替换了启动子的PX601表达载体进行连接。

4.权利要求2或3所述的CRISPR/SaCas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用，其特征在于，所述药物中包含一种或多种权利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系统。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/SaCas9系统被包装于AAV8血清型重组腺相关病毒基因组中。

6.一种含有一种或多种权利要求2或3所述CRISPR/SaCas9系统的组合物，其特征在于，所述组合物含有制药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备为注射剂。

8.一种非诊断或治疗目的的抑制HBV复制的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求2或3所述一种或多种CRISPR/SaCas9系统导入宿主细胞或者生物体中；以及

(2)表达权利要求2或3所述一种或多种CRISPR/SaCas9系统，并在所表达的导向RNA和SaCas9核酸酶共同作用下，破坏共价闭合环状DNA。