[发明专利]一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用

说明书

本发明公开了一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用。根据CRISPR的gRNA的设计原则及不同基因型HBV序列的保守性区域，筛选3条gRNA并构建在PX601表达载体上，同时选择不同肝脏特异性启动子与HBV病毒基因组的增强子进行组合，筛选出2个启动子组合对表达载体PX601进行改造。在细胞模型和小鼠模型中利用上述gRNA指导的CRISPR改造系统，可以在显著提升SaCas9的肝组织表达特异性的同时，有效的抑制乙型肝炎病毒基因的表达和复制。该系统易于操作、安全性高、对HBV复制的抑制效率高。该改造的CRISPR/SaCas9系统有望成为治疗乙型肝炎病毒新型治疗药物。

技术领域

本发明属于基因突变和基因工程技术领域，具体涉及对能够被腺相关病毒(AAV)载体递送的CRISPR/SaCas9核酸酶系统的改造，选取高效且更具安全性的肝脏特异性表达SaCas9核酸酶的启动子组合，并针对多种基因型和亚型的乙型肝炎病毒保守序列，设计、构建、筛选最优的指导RNA及其靶位点序列。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种能引起患者慢性感染，增加肝硬化和肝癌风险的病毒。据统计，全球大约有2.91亿人口感染乙型肝炎病毒，每年约有100万人因为乙型肝炎及其引发的肝硬化和肝癌失去生命。因此，病毒性乙型肝炎是威胁全球健康的一个重要问题。核苷(酸)类似物(NUCs)和干扰素(IFN)是目前治疗HBV仅有的两类药物，然而这两类药物均无法清除稳定存在于细胞核中且能够作为模板产生子代病毒的闭合共价环状DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)，此外，HBV耐药相关突变(RAM)和疫苗逃逸突变(VEM)也降低了现有治疗和预防策略的成功率。因此，人们在努力开发直接靶向cccDNA，将之失活或清除以实现治愈慢性乙肝的治疗手段。

CRISPR-Cas系统是在原核生物中发现的一种获得性免疫系统,根据行使功能的蛋白组成作用方式不同分为两类，六种型。其中Ⅱ类系统的Type Ⅱ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPR RNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif)附近特异性剪切DNA双链，形成DSB(double strandbreak)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-HomologousEnd Joining NHEJ)DNA修复方式，另一种是同源重组修复(Homology Directed RepairHDR)方式。

特异性靶向HBV基因组保守区域的CRISPR/Cas9基因编辑系统，不仅能够有效抑制病毒复制，相比其他基因编辑工具，设计也更加简单灵活，成为了一个十分具有吸引力的治疗选择。目前已经有大量的研究证明了CRISPR/Cas9系统可以有效抑制HBV的复制^[1-6],但真正将其投入到治疗应用之前,还需要解决几个重要的问题：首先是如何高效安全的递送CRISPR/Cas9系统；其次是关于CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，CRISPR/Cas9在识别并切割靶位点的同时，也可能对与靶位点相似的DNA序列同样进行切割。