[发明专利]一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物

将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；

所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)筛选特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物

对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物；

步骤2)中，VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下：

将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，

将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；

所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液；

所述维生素K工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K浓度为30-80μmol/L的维生素K工作液；

所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：分别取VKOR蛋白和缓冲液1，配制得到VKOR蛋白浓度为1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；

缓冲液1的组成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水；

缓冲液2的组成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶剂为水；pH值7.0-7.6；

缓冲液3的组成包括：维生素K环氧化物1-50mmol/L，溶剂为异丙醇；

缓冲液4的组成包括：维生素K1-100mmol/L，溶剂为异丙醇。

2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex。

3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因，甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L。

6.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述终点法计算荧光值的增加量为：用荧光检测仪每隔一段时间检测一次荧光，检测总时长为1-2小时；VKOR蛋白的活性＝反应1小时的荧光值F_T1-反应开始时的本底荧光值F_T0。

7.一种如权利要求1-6中任一项所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法筛选出的小分子化合物。