[发明专利]一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。本发明通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系(即双报告基因细胞体系)，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测筛选出的小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，可以得到特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物。采用该方法，本发明首次筛选到一些结构不同于香豆素类的衍生物和苯茚二酮类的衍生物的化合物，它们能特异性抑制VKOR蛋白活性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值，是开发灭鼠药和抗凝药物的先导化合物。

技术领域

本发明涉及一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。

背景技术

维生素K在血液正常凝固中发挥重要作用，主要用于防止新生婴儿出血疾病、预防内出血以及维生素K拮抗剂的解毒剂。维生素K通过调节一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻译后修饰参与凝血(如图1所示)。维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化修饰是其发挥凝血功能的必要条件。维生素K在这一翻译后修饰过程中发挥核心作用，并以三种形式在体内循环，分别是维生素K环氧化物(KO)、维生素K(K)和二氢维生素K(KH₂)。

目前已知两个酶在维生素K循环中发挥作用。其中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)利用KH₂为辅因子，对维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基进行γ羧基化修饰，同时把KH₂转化成KO。为了使GGCX的催化反应可以持续进行，KO必须被还原成KH₂，而这一反应主要是由具有KO还原酶活性和K还原酶活性的维生素K环氧化物还原酶(VKOR)催化的。VKOR催化KO到K，以及K到KH₂，使维生素K可以循环利用。研究表明，VKOR是临床抗凝血药物华法林(warfarin)的特异性作用靶点，华法林通过抑制VKOR的活性，使KO不能转化为K和KH₂，从而阻断了维生素K循环，进而抑制凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基的γ羧基化修饰，达到抗凝血的目的。此外，杀鼠药溴敌隆也是特异性靶向VKOR的抑制剂。因此维生素K循环的关键酶(VKOR和GGCX)都是开发抗凝血药物(或杀鼠药)的重要靶点。

目前抑制VKOR活性的小分子都是香豆素类的衍生物或苯茚二酮类的衍生物，但还不清楚是否存在其他化学结构不同于这两类化合物的VKOR抑制剂。因此开发一种靶向VKOR的小分子化合物的筛选方法对获得VKOR抑制剂具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法。

同时，本发明还提供一种通过上述方法筛选出的小分子化合物作为制备靶向维生素K环氧化物还原酶的抑制剂的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法，包括以下步骤：

1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物

将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；

所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)筛选特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物

对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物。