[发明专利]规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法

权利要求书

1.一种规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述规模化合成长链RNA的方法包括：

a、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段和3'PolyA尾端，所述RNA短片段的长度为100～170nt，以使多个所述RNA短片段和所述3'PolyA尾端能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计多个夹板DNA片段，任一所述夹板DNA片段与相邻两所述RNA短片段的3’端和5’端分别互补配对，所述夹板DNA片段的长度大于30bp，小于40bp；混合多个所述RNA短片段、所述3'PolyA尾端与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；

b、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；

c、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；

d、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA；

所述RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；所述夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。

2.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤a中所述连接混合物的RNA短片段与夹板DNA片段的摩尔浓度之比为8～10:11。

3.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。

4.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤c中的所述帽子结构包括Cap 0结构或Cap 1结构。

5.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤d去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA的步骤之后还包括：

e、纯化：将步骤d中得到的长链RNA进行氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的至少一种，以获得纯化后的长链RNA；

f、纯度检测：将步骤e中得到的纯化后的长链RNA进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳、HPLC分析检测、内毒素残留检测、DNA残留检测以及蛋白残留检测中的至少一种。

6.一种定点修饰长链RNA的方法，其特征在于，所述定点修饰长链RNA的方法包括：

a1、设计合成如权利要求1至5任一项所述的规模化合成长链RNA的方法中的RNA短片段和夹板DNA片段，并对指定的RNA短片段进行定点化学修饰；

b1、连接步骤a1中合成的RNA短片段、定点修饰后的RNA短片段及夹板DNA片段，以得到经过定点修饰的未加帽的长链RNA；

c1、对上述步骤b1中得到的经过定点修饰的未加帽的长链RNA加帽，得到经过定点修饰的加帽的长链RNA；

d1、去除步骤c1中得到的经过定点修饰的加帽的长链RNA中的夹板DNA，以得到所需的经过定点修饰的长链RNA；

e1、对步骤d1中得到的经过定点修饰的长链RNA进行纯化和纯度检测。