[发明专利]规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法

说明书

本发明公开一种规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：设计RNA短片段和夹板DNA片段；连接；加帽；去夹板DNA片段等步骤。本发明技术方案通过化学法合成大量RNA短片段和不同的夹板DNA片段，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来以形成目的RNA长链。整个工艺操作简单、生产成本低，产物长链RNA的突变率低，并且单次反应可对多条RNA短片段进行组装，可高通量合成长链RNA，以满足长链RNA的规模化生产。此外，通过在RNA短片段上进行化学修饰，可实现对长链RNA的定点修饰。相较传统RNA化学修饰方法，本方法得到的RNA产物稳定性更高、免疫源性降低、翻译效率明显增强，对于RNA药物在临床上的应用有极其重要的作用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法。

背景技术

随着生物技术的迅猛发展，siRNA、非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA技术飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(John C等.ChemistryBiology.2012，19(1)：60-71)，以往的一些合成方法已逐渐不能满足科研试验和药物研发对RNA的需求，越来越多的RNA生物学研究和药物研发中需要用到毫克级甚至克级的高纯度RNA，与此同时对RNA产品的质量也提出了更高的要求(Laura E等.RNA.2010，16(3)：647-653)。目前RNA合成的主要方法是化学合成法，该方法的最大优点是可以规模化合成，但是也存在缺点和技术限制，其一是价格昂贵，其二是现有合成技术水平只能合成短链RNA分子，合成RNA的长度一旦超过170nt左右时，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，这不仅加大了下游纯化的难度，还进一步推高了成本(张中华.生命科学.2004,16(4)：231-235)(Junichi Yano等.Advance inPolymerScience，2012,249:1-48)(赵松子等.西北农业学报.2010，16(5)：47-51)。目前，大多数研究人员往往通过转录合成的方法获得大于40nt左右的RNA，即用T7、T3或SP6 RNA聚合酶转录带有其启动子的双链DNA模板以获得长单链RNA(SA McKenna等.NatureProtocols.2007，2，3270-3277)。一般情况下，通过优化转录条件中的Mg²⁺、三磷酸核苷酸(rNTP)的浓度，一个拷贝DNA模板能产生几十到数百个拷贝的RNA，因此通过这种方法可以得到较大量的RNA产物。但是由于采用化学合成法的过程中需要对2'-OH进行保护，使得RNA的化学合成比DNA的化学合成更有难度。目前，通过化学合成法合成的RNA的长度不超过170nt，无法满足长链RNA的合成需求(其链长大于1000nt)。

采用生物合成RNA的方法具有诸多优点，例如可以进行同位素标记或荧光染料进行标记；转录长度不受限制等，因此其广泛用于核酸结构或生物学研究。然而，转录合成RNA分子也存在一些问题：无法实现稳定的规模化生产。其原因在于由于体外转录合成不同长度的RNA需要RNA聚合酶参与，其在生物反应上会造成一定几率的错配，从而引起RNA序列突变，不利于扩大生产。同时，需要制备大量的质粒并用DNA限制性内切酶切成线性质粒；或需要通过大量的PCR反应获得线性模板，而一些具有稳定二级结构的长链RNA(RNA分子5'端和3'端不完全或完全互补碱基数不少于5个)的DNA转录模板单链也会相应具有稳定二级结构，这导致利用DNA引物PCR扩增转录模板时产生非特异性或突变DNA产物，而这些非目的DNA转录的RNA与目的RNA的生物学功能截然不同，因此无法通过PCR方法获得足够量的正确DNA转录模板。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种规模化合成长链RNA的方法及定点修饰长链RNA的方法，该方法首先利用化学法合成大量RNA短链片段，然后通过生物合成法将RNA短链片段连接成长链RNA，以克服相关技术中无法规模化生产长链RNA的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种规模化合成长链RNA的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：