[发明专利]具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用

权利要求书

1.一种可适用于简单节杆菌的目标启动子文库，其特征在于：所述目标启动子文库是在表达载体pART2野生型启动子hdnOp的基础之上，通过随机突变和定点突变技术获得的启动子突变体，其序列为：SEQ ID NO.3，和/或为SEQ ID NO.4，和/或为SEQ ID NO.5，和/或为SEQ ID NO.6，和/或为SEQ ID NO.7，和/或为SEQ ID NO.8，和/或为SEQ ID NO.9，和/或为SEQ ID NO.10，和/或为SEQ ID NO.11，和/或为SEQ ID NO.12，和/或为SEQ ID NO.13，和/或为SEQ ID NO.14，和/或为SEQ ID NO.15，和/或为SEQ ID NO.16。

2.如权利要求1所述的可适用于简单节杆菌的目标启动子文库的构建方法，其特征在于：步骤如下：

⑴在质粒pART2上野生型启动子hdnOp 5’端引入限制性酶切位点EcoRV，获得重组质粒pART2A，便于后续启动子突变体替换质粒上的野生型启动子；

⑵将绿色荧光蛋白EGFP编码基因与pART2A连接构建重组质粒pART2A-EGFP；

⑶根据步骤⑴中野生型启动子的序列，设计随机突变引物和定点突变引物；随机突变引物设计的目的是在全启动子区域通过易错PCR引入随机突变，定点突变引物设计的目的是删除原始启动子序列-10区的碱基C，或增加核糖体结合位点到起始密码子之间的碱基个数；

⑷以步骤⑵中重组质粒pART2A-EGFP为模板，使用步骤⑶中的突变引物PCR扩增得到含有突变位点的启动子核苷酸序列，将其替换质粒pART2A-EGFP上的野生型启动子；或含有突变位点的全质粒，共同组成表达EGFP的启动子突变体质粒库；

⑸将步骤⑷中得到的启动子突变体质粒分别转入大肠杆菌E.coli DH5α中，利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞；将上述获得的细胞涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养；

⑹挑取步骤⑸中的单菌落于液体LB试管中过夜培养，利用酶标仪检测荧光强度，获得在大肠杆菌中相对于野生型启动子hdnOp具有不同表达强度的启动子突变体；

⑺从步骤⑹获得的在大肠杆菌中具有不同表达强度的启动子突变体中，按表达强度筛选出梯度差异的启动子突变体电转入简单节杆菌中，培养至稳定期，利用酶标仪检测荧光强度，获得在简单节杆菌中具有不同表达强度的目标启动子文库。

3.包含如权利要求1所述的目标启动子文库的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。

4.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述简单节杆菌工程菌株还包含野生型irrE_(W)或irrE_(W)突变基因irrE_(M2)，所述野生型irrE_(W)基因编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1；所述irrE_(W)突变基因irrE_(M2)编码的氨基酸序列为：SEQ ID NO.17。

5.根据权利要求3所述的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，其特征在于：所述irrE_(W)突变基因irrE_(M2)能够显著提高简单节杆菌的有机溶剂耐受性；

或者，所述irrE_(W)突变基因irrE_(M2)携带四个突变位点，分别为Arg111His，Asp130Asn，Glu182Gly和Ser230Gly。