[发明专利]具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用

说明书

本发明涉及一种采用启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法获得的具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株。本菌株在高浓度有机溶剂(8％)和底物(15‑45g/L)转化体系中仍保持良好活性，其C_1,2脱氢反应产率较对照菌株I(含野生型启动子和野生型irrE)提高了1.1‑2.2倍。这种优良胁迫耐受性工程菌株的构建及其应用，提高了转化体系中有机溶剂和底物的浓度，进而提高了产物生成量，对于甾体类疏水性化合物高浓度底物转化效率的提高具有重要的指导意义。

技术领域

本发明属于代谢工程和微生物转化技术领域，尤其是一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用。

背景技术

甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物，具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，此外，甾体激素还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。甾体化合物的C1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。简单节杆菌(Arthrobacter simplex)是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株，具有专一性高、反应速率快等优点。如它对醋酸可的松(CA)表现出高活性，生成的产物醋酸泼尼松(PA)的抗炎活性增大了3～4倍。然而，甾体类化合物较差的水溶性(溶解度一般为10^-5-10^-6mol/L)限制了底物与胞内生物酶的有效接触，进而限制了催化反应效率。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。此外，转化体系中高浓度的底物和产物也会对菌株的活力产生抑制作用，进而影响其转化产率。因此，提高菌株的胁迫耐受性，尤其是有机溶剂耐受性，是创建高效菌株的有效策略。

IrrE是来源于耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的一个全局转录因子。研究者发现，该基因导入宿主菌后能对胞内的整个代谢网络产生重要的调控作用，进而改善生物体的各种胁迫耐受性。但大量的研究表明，基因表达水平与复杂目标表型之间存在着非线性的关系。为了获得理想表型，需要对该基因在宿主生物中的表达水平进行精细调控。

启动子是一段能够被RNA聚合酶特异性识别并结合从而起始转录的DNA序列，它的结构组成显著影响基因的转录水平。大多数原核生物中，启动子核心区域主要由-10区和-35区组成，这两个保守区域是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。因此，启动子和σ因子之间序列相似性越高，启动子的强度越高。此外，核糖体结合位点与起始密码子之间的距离也是影响基因表达水平的重要因素。目前，研究者主要采取易错PCR或定点突变技术构建启动子文库，从中筛选得到能对基因表达水平进行精细调控的有效表达元件。

全局转录机制工程是一种全新的改进细胞表型的定向进化方法，通过易错PCR、DNA shuffling等技术对细胞中的转录元件进行突变修饰，进而改变RNA聚合酶的转录效率和对启动子的亲和能力，使细胞的转录在整体水平上发生改变。因此，该方法在改善由多个基因控制的复杂表型上具有显著的优势。

目前尚未发现采用启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对irrE基因的表达水平进行精细调控及其定向进化去构建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，以及利用该工程菌株进行甾体C_1,2脱氢反应的报道。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开专利文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用，本发明通过启动子工程、全局转录机制工程或者二者相结合的方法，对全局转录因子IrrE的表达水平进行精细调控和定向进化，创建具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，为高效简单节杆菌的构建提供一种新策略。