[发明专利]一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法

权利要求书

1.一种高活性预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，其特征在于，该方法只需一步操作就可以完成乳铁蛋白的糖基化修饰，修饰后的糖基化产物无需冻干、溶解性良好、促成骨细胞增殖活性高、MAPK细胞增殖通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致，该方法按照以下步骤进行：

（1）乳铁蛋白糖基化产物的制备：将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:1-1:10的比例加入葡萄糖、果糖或者半乳糖、充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；

（2）糖基化产物预处理：用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h，根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用；

（3）糖基化产物对成骨细胞增殖作用；将100 μL浓度为1×10⁴-1×10⁶个/mL的成骨细胞于96孔板中过夜培养，加入不同浓度的糖基化产物，获得两种糖基化产物比未修饰的乳铁蛋白显著地促成骨细胞增殖，二者促骨细胞增殖的通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳铁蛋白糖基化产物较未修饰的乳铁蛋白的抑制骨质疏松的活性显著地提高。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于通过MAPK通路对两种糖基化产物的增殖途径进行分析，发现两种产物的作用途径与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白增殖相一致，但活性更好。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于步骤（1）乳铁蛋白糖基化产物制备，将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:1-1:10的比例加入单糖、充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；步骤（2）糖基化产物预处理，用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h，根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法：乳铁蛋白糖基化产物溶解性良好、抑制骨质疏松活性高、MAPK细胞增殖通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致。